在当代生物医学史上，有很多辉煌的瞬间。为解决一个科学或技术上的问题，科学家和研发人员们冥思苦想，试尽各种手段而不得入其门。然而在某一瞬间，一个全新的思路、一个突如其来的想法在他们的脑海中闪现。这些想法被验证后让问题迎刃而解。还有的时候，一个实验在屡次失败、几乎绝望的情况下会突然获得意想不到的成功。这些瞬间改变了个人的命运、公司的前途、和科学技术的历史进程。它们可能是所有科研人员梦寐以求、苦苦追寻的那种时刻。它们是日积月累百转千回后的刹那爆发，是山穷水尽柳暗花明时的豁然开朗。本系列将捕捉、记录几个这样的瞬间。这篇讲述的是 Hybritech 公司和ICON技术的故事。现在市场上的验孕棒和很多快速诊断手段都是建立在ICON技术基础之上。
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Hybritech公司和TANDEM技术
1978年，Ivor Royston 和 Howard Birndorf 在美丽的南加州圣地亚哥联合创立了 Hybritech，旨在开发新兴的单克隆抗体技术。公司名字是由 “hybridoma”（杂交瘤）和 “technology”（技术）两个词合成的。著名的VC公司凯鹏华盈（KPCB）是它的主要投资人。在 KPCB 的合伙人 Brook Byers 的推动下，Hybritech主攻诊断行业。在1981-1986期间，他们推出了一系列以单抗为基础的诊断试剂盒，包括IgE（诊断过敏）、HCG（测怀孕）和PSA（筛查前列腺癌）等诊断产品。
在 Hybritech 之前，诊断试剂盒都是以多克隆抗体为基础，存在很多缺陷。首先，多克隆抗体每次生产都需要接种动物，流程复杂，成本高，而且无法保证批次与批次之间的稳定性。第二，多克隆抗体的特异性差，和靶抗原之外的其它抗原也会结合，测试容易出现假阳性。第三，多抗对靶抗原的亲和性不高，导致测试的灵敏度低。第四，以多抗为基础的诊断手段几乎全都用到放射性同位素，而且流程繁琐，需要使用离心机，还要多点校正。第五，多克隆抗体无法确定其在靶抗原上的结合表位，这让很多后来流行的“三明治“式免疫检测手段无法实现。而用单克隆抗体取代多抗，这些缺点就都可以避免。
Hybritech 最初的几个产品都是建立在自主开发的TANDEM技术之上。TANDEM是今天 “三明治” 式免疫检测技术的雏形。让我们以 TANDEM-HCG 检测方法为例来了解一下这一技术（图1）。HCG或人绒毛膜促性腺激素是胚胎周围细胞（着床后形成胎盘）分泌的一种蛋白激素，它在孕妇血液和尿液中的浓度会大幅上升。检测女性尿液中的HCG浓度就成为怀孕检验的标准手段。TANDEM-HCG试剂盒中包括两个靶向HCG的小鼠单抗，一个靶向HCG的α亚基（“一抗”），固定在塑料珠子的表面；另一个靶向HCG的β亚基（“二抗”），游离在溶液中。二抗或者用同位素标记，或者和酶偶联。偶联的酶会把无色的底物转变为有色的产物。一抗的作用是捕捉、固定抗原，而二抗的作用是产生信号，便于定性或定量测定。
图1. TANDEM-HCG测试的工作机理。注：图中HCG形象来自参考资料4
Hybritech的主要客户是临床实验室，主要竞争对手为雅培、罗氏等大公司。Hybritech是第一家将单抗技术引进诊断产品的公司，在创立早期占有技术优势。但由于单抗杂交瘤技术的两位发明人并没有申请专利，其它竞争对手也有可能快速跟进，所以Hybritech在成立初期小心翼翼，尽量避免和大公司正面交锋。比如，他们特意避免去开发乙肝病毒测试盒，那是雅培的一个主要诊断产品。虽然他们预测使用单抗会显著提高这一产品的灵敏性和特异性，但他们并不想过早地引起雅培的注意。然而，竞争的到来是必然的，只是早晚的事。当Hybritech推出TANDEM-HCG产品时，由于其测试时间只要1小时45分钟，而且性能优于市场上其它竞争产品，它迅速地成为市场领头产品。不久罗氏也推出了类似的HCG诊断产品，将测试时间缩减到1小时30分钟。TANDEM-HCG 的销售增长因此出现停滞。Hybritech面临的挑战一是要不断推出更好的新产品，二是要不断改善旧产品，保持甚至扩增已有的市场份额。我们故事的主角就是在这个时刻低调出场的。
古那司.沃克斯 (Gunars Valkirs)
古那司.沃克斯 （Gunars Valkirs）是土生土长的圣地亚哥人。他对数学有极高的天分，但又不想做纯粹的数学研究。于是在读本科时他选择了加州大学圣地亚哥UCSD的物理专业。1974年，大学毕业前夕，沃克斯在申请研究生院时收到了哈佛的录取通知书。他的本科指导教授则劝他留在UCSD，在他的实验室完成博士学位，并答应给他助研奖学金，这样他在研究生期间只需专心科研，而不需要教课。沃克斯同意了。其实使他留在圣地亚哥的最重要的因素是天气—— 他担心自己忍受不了波士顿漫长而又寒冷的冬天。
图2. 1997年的古那司.沃克斯 (Gunars Valkirs)。图片来源：参考资料8
沃克斯攻读博士的过程并不顺利。他要拿的是物理学博士学位，但论文课题是用免疫手段研究光合细菌的膜蛋白。也就是说他的科研是跨界的——他学的是物理课，研究生资格考试考的也都是物理科目，而做的实验却是生物方面的。这种错位让他在遇到困难的时候很难找到合适的人指导。好在他的导师对他比较宽容，并不催促他毕业。这样，他花了8年的时间才获得了博士学位。
在读博期间，沃克斯就一直关注当地的Hybritech公司——阳光下山顶上那群闪闪发光的建筑格外惹眼。他也了解Hybritech的技术和产品，感觉和自己的研究方向很契合。1981年12月的一天，他径直来到了Hybritech，和前台说自己要申请工作。他填写了几份表格便离开了。Hybritech是他当时申请的唯一一 家公司，这也是他人生中唯一的一次求职经历。
沃克斯遇上了一个很好的时机。Hybritech刚于1981年10月完成IPO，银行账户里存着刚募集来的一千两百万美金。Hybritech雄心勃勃，准备招兵买马，扩大规模。在经过一天的面试后，沃克斯于1982年2月收到了Hybritech的聘函。他的聘用后来让 CFO Tim Wollaeger 迷惑不解，“我们招一个物理博士干什么？”沃克斯的探索
沃克斯的主要工作是改善TANDEM诊断技术，提高它的速度和灵敏性。他很喜欢Hybritech的工作环境。实验室里的仪器都是新的，这和学校不一样。他和同事们也相处融洽，虽然怪人不少，但好在大家之间平等、自由。
在沃克斯到来之后，Hybritech推出了TANDEM显色技术。一抗被固定在直径为0.6厘米的尼龙珠子表面，测试时需要取一个珠子放在试管里，再添加待测样品液和酶联二抗。二抗上偶联的是碱性磷酸酶（alkaline phosphatase）。三样东西混合好之后，需要不断摇晃30分钟，以便形成 “尼龙珠-一抗-HCG-酶联二抗” 的复合体。之后，还要将尼龙珠反复清洗，洗掉没有结合的二抗。接着在溶液中加入底物磷酸吲哚酚（indoxyl phosphate），最后再等30分钟。磷酸吲哚酚被碱性磷酸酶转变为靛蓝（indigo blue）。这个浅蓝色的溶液再被放到光谱仪里读取它在405纳米的吸光度。这种改进的技术将测试的时间缩短到了1小时15分钟。
即便如此，沃克斯仍然需要继续改进TANDEM显色技术，但花了很长时间并没有找到好的方法。在他加入 Hybritech 两年后，一个突破的契机终于出现了。
1984年1月，在一个实验室会议上，沃克斯被要求介绍一下免疫测定中的反应动力学。这促使他开始从这个角度思考免疫检测技术。抗体与抗原结合的速率与抗体的浓度成正比。抗体的有效浓度越高，待测的抗原与之结合的速度越快。提高抗体有效浓度的一个方法是增加其附着在固体基质上的密度，另一个方法是增加固体基质表面积和样品液体积的比例。比如将一个大珠子换成很多很小的珠子，在抗体表面密度不变的情况下，可以缩短反应时间。沿着这一方向思考，也许珠子不是最合适的固体基质几何形状。圆珠作为固体基质还有一个重要缺陷。根据流体力学的理论，溶液中的珠子表面会形成一个相对静止的溶剂包围层，阻止了抗原接近一抗，也就增加了反应时间。沃克斯需要从圆珠里 “跳” 出来。
ICON技术的诞生
用什么形状的固体基质可以增加其表面积和样品液体积的比例呢？沃克斯想，如果说使用珠子是溶液包围基质，那么为什么不用基质包围溶液？把珠子换成一个内部充满微小孔洞的薄膜就可以做到这一点。薄膜内的孔洞虽小（微米级，肉眼无法看出），但其尺寸还远远大于抗体的维度（纳米级）。如果抗体涂满了每个孔洞的内壁，从薄膜中流过的溶液中的抗原则可以四处碰壁，轻易结合被拴住的抗体。这实际大大增加了一抗的有效局部浓度，也就大幅缩短了抗原-一抗的平均结合时间。
图3. 尼龙膜的扫描电镜照片。图片来源：http://www.hawach.com/products/nylon-membrane-filters/
沃克斯在纸上写下了一个反应动力学公式，再进行一番演算推导，然后代入从实验中得到的和从文献中查到的数据。他的结论是在半秒的时间内，膜内溶液中接近70%的HCG已结合上一抗！（图4再现了沃克斯的计算过程，用到了一点微积分。有兴趣的朋友可以研究一下。）酶联二抗与一抗-HCG结合的动态过程和速率与第一个结合过程类似。图4. 沃克斯在纸上的计算。他的结论是如果使用薄膜，膜内溶液中大部分抗原在不到1秒的时候已和固定的一抗结合完毕。
膜内溶液体积有限。他需要找到一种方法迫使溶液能单向穿膜而过，不断有新的样品液补充进来。一个半径为1厘米的圆膜能浸满约40微升的液量，如果每半秒完全换液一次， 那么0.5毫升的样品液全部浸膜而过需要13次换液，总时间不到7秒钟。这将是对 TANDEM 技术的另一项改进—— 用强制单向流过取代被动扩散。
沃克斯兴奋不已。这套方法在理论上立得住脚，下面他需要用实验来证明它的可行性。沃克斯开始因地制宜地组装第一个简易装置。他把一个试管的底部切掉，把几个香烟的过滤嘴塞进去，再铺上一个玻璃纤维膜。经过处理的玻璃纤维膜载满了一抗蛋白，而过滤嘴纤维则起到吸液的功能，通过毛细管现象不断引流膜里的溶液，迫使膜内换液。
沃克斯开始了第一个实验。他在膜上滴了5滴阳性样品液和3滴酶联二抗溶液，过了一分钟，再用2毫升的洗液连续洗膜，把没有结合的酶联二抗洗脱掉。沃克斯屏住呼吸，往膜上滴加了3滴底物溶液。检验的时刻到了！不到一分钟的时间，纤维膜上出现了蓝色，而且越来越深。如同慢镜头里夜空中的烟花，试管里的靛蓝色在他眼前徐徐绽放，令他猝不及防、欣喜若狂。
在新思路指导下的第一个实验就这样成功了。沃克斯的任务是将TANDEM的测试时间砍掉20%，没想到他竟将其缩短了90%。一个5分钟的测孕方法诞生了。这一新技术已超越了TANDEM的模式，后来被命名为ICON（代表 immuno-concentration 或免疫浓缩）。快速怀孕检测试剂盒的推出
不久后的一天，Hybritech 的营销总监 Cole Owen，在经过一个实验室时，看到沃克斯坐在地上，一手拿着锤子，一手拿着一个长条木块儿，正嘭嘭地敲打几块类似于纱布的东西。他不禁问沃克斯：“你到底在干嘛？” 沃克斯给他讲了他的尝试和已经成功的实验，并告诉他正准备制备更多的膜，再重复几次。Owen听完眼前一亮。他以前在强生公司工作过，非常了解验孕诊断技术的发展历史。在强生首次推出以（多抗）免疫技术为基础的测孕诊断产品之前，测孕必须使用活的青蛙。“当我意识到沃克斯在做什么时，我差点儿灵魂出窍！” 他马上回到办公室，打了几个电话，四处寻找替代香烟过滤嘴的更好原材料。
ICON-HCG 项目刚开始并没有受到公司重视。研发人员都意识到这一技术的巨大优势，但公司的资源有限，大部分人力已被其它项目占据。于是有一天，沃克斯拿着他的简易装置，敲开了 CFO Tim Wollaeger 办公室的门，当场给他演示5分钟的测孕过程。“太神奇了！简直是魔术！” Wollaeger 被彻底征服了。他开始向其他高管极力推荐这一项目。Hybritech总裁David Hale提议由Wollaeger来带头成立项目团队来推动此事，他欣然同意。至此，ICON-HCG项目开始进入产品开发阶段。
沃克斯的简易装置离可以销售的产品还有相当长的距离要走，有大量的工作要做。开发团队开始设计可以批量生产的产品。香烟过滤嘴被换成可大量购买的醋酸纤维素，玻璃纤维膜被换成了尼龙膜，在膜与醋酸纤维素吸床之间又添加一个多孔的塑料支架（图5）。一抗也不需要附着在一整片膜上，而只是集中在膜正中间一个直径为半厘米的圆形区域。如此一来，阳性结果是由白色膜正中的一个蓝点显示，增加了对比，更容易判断结果，也节省了一抗的用料。图5. ICON装置的剖面图。右图是得到阳性结果时，从上往下看到的效果图。注: 左图来自参考资料9
ICON-HCG申报走的是510(k)途径，需要数据证明它和市场上已销售的某种诊断产品等效。Hybritech获得了当地的计划生育诊所（Planned Parenthood Clinics）提供的600多个尿样。他们用这些样品对ICON-HCG和TANDEM-HCG进行比较, 很快完成了临床试验，并获得了FDA批准。1984年9月30日，Hybritech给客户发出了第一批ICON-HCG试剂盒。此时距离沃克斯的第一个实验只有8个月的时间。
在ICON-HCG产品开发及上市头一年，它的生产全靠手装。Hybritech还没有来得及设计自动化生产流程。公司全体成员，不论职位，只要有空儿就用食堂托盘盛上原料和部件，加班加点地组装测孕试剂盒。
在第一次销售动员会议上，50个销售代表每人抢到了一个刚组装完的试剂盒。在会议中间歇息时，他们迫不及待地跑到办公室给客户打电话：“我现在还在开会，等会议一结束就去见你。你不知道我们的新产品有多酷!” Hybritech的销售经理Kim Blickenstaff有一次到德克萨斯州的一个医疗中心去宣传快速测孕盒。消息迅速在几个医院内部散开。几名医护人员从走廊追到了电梯里，从电梯里出来后迫不及待地要求Blickenstaff立刻演示一下产品的操作。在一大堆人的围观下，Blickenstaff就在电梯旁边的打印机上做了一个测试。他从未见过如此疯狂的场面。
Hybritech把ICON-HCG定价为每盒三美元，比市场上竞争产品高出一块钱，目标是抢占市场顶端。ICON-HCG产品一上市，销售就远超预测，仅12月份就卖出一百万个诊断盒。不到一年的时间，ICON-HCG夺得了40%的市场份额，贡献了Hybritech全年销售额的三分之一。头3年的累积销售额达到3千万美元（相当于今天的7.3千万美元）。ICON-HCG也开辟了新的市场。除了临床实验室，每个急诊室也开始装备这一产品。当面对一个女性患者时，急诊医生需要确定的第一个问题是她是否已经怀孕，然后才能决定是否进行X射线检测、该服用什么药。在ICON-HCG推出之前，医生没有快速而有效的方法回答这一问题，只能问患者本人。但很多情况下患者本人也并不清楚。ICON-HCG测试既快速又准确，让急诊医生不再因此而伤脑筋。
由于不需要使用任何仪器，ICON-HCG 又进一步扩展到了医生办公室。之前的流程是，女士想要知道自己是否怀孕，需要约见医生，然后带走一个杯子。第二天早晨她先在家采集尿样，再送回到医生办公室。护士再把尿样送到临床实验室，大约需要一天的时间才收到结果。医生最后将结果告诉那位女士。而如今医生办公室已配备了ICON-HCG，快速而灵敏，不需要使用晨起后的初尿，结果立等可取，再也不需要三天的等待时间。
几年以后，在Hybritech被礼来收购后，其它的公司推出了家用测孕棒，将市场进一步扩展。家用测孕棒沿用的还是 ICON-HCG 的基本机理，但引进了横向流动（区别于ICON的纵向流动）和胶体金颗粒。今天全世界每年卖出17亿个验孕棒。它们都源自1984年1月的那个实验。沃克斯的后续精彩人生
ICON的成功让沃克斯成为公司的英雄。他获得了更大的自由去钻研其它项目，并可以招人帮助自己。1986年，礼来以4.5亿美元的价格收购了 Hybritech。一年多以后，由于文化和理念的冲突， Hybritech 的骨干陆续离开了礼来，其中包括沃克斯。
沃克斯和三名 Hybritech 的前同事于1988年联合创立了Biosite公司，把ICON技术和单抗技术应用到小分子检测上。经过最初几年的挫折，Biosite 陆续推出毒品检测、心脏病检测等产品。在2000年 – 2005年期间，公司的年销售额已超过2亿美元，并以每年平均46%的速度增长。2007年，诊断公司 Inverness （2010年改名为Alere，2017年被雅培收购）以16.8亿美元的价格收购了Biosite.
退休后的沃克斯移居到了夏威夷的茂宜岛。他租用了一个占地50英亩的农场，和当地的大学合作，尝试能否在夏威夷大规模种植可可树。实验成功了，但等到约7千棵可可树第一次丰收的时候，沃克斯却为如何处理这么多的可可豆犯了愁。从夏威夷往外运送可可豆的成本太高。沃克斯干脆成立了一家公司，在离农场2英里的地方建了一个巧克力工厂，加工这些可可豆。他和家人也不缺钱花，就宣布把公司的所有净利润全部捐给茂宜岛当地的公益组织。消息一传出，立刻造成轰动，引起媒体争相报道。
2020年3月15日，在夏威夷茂宜岛，沃克斯公司旗下的第一家实体巧克力店开张了。该店出售世界一级的黑巧克力和牛奶巧克力，每类巧克力又有四种风味：薄荷、血橙、柠檬草和茂宜咖啡。但不到一周，由于新冠病毒疫情的爆发，巧克力店暂时关闭。好在人们随时可以在网上购买该店的巧克力。
图6. 沃克斯在自己的巧克力工厂里工作。右图为他们生产的巧克力，每片重5克。图片来源：参考资料12
今年7月份，当我在电话里采访沃克斯时，我问他是否还记得36年前的一些细节。他笑了。每个公式、每个实验他都铭记在心。尤其是第一次在他眼前盛开的那一抹靛蓝。
致 谢
感谢 Gunars Valkirs 博士在百忙之中通过电话接受我的采访，并通过email回答我的后续问题。他的人生中有很多精彩瞬间。感谢他和我分享其中之一。
参考资料
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