MSTN基因敲除犬“大力神”与“天狗”

撰文 | 王晓民（中科院广州生物院）

2005年，世界首例体细胞克隆犬在韩国诞生。此后，转基因克隆犬也相继问世。但是，关于犬基因敲除及基因敲除克隆的研究却一直未有任何进展。

近年来，随着CRISPR/Cas9技术兴起，基因编辑效率的大幅度提高，使犬基因编辑与基因编辑克隆也相继获得成功。下面，让我们来一起回顾一下犬基因编辑与克隆的历程吧。

世界首例基因敲除犬

2014年6月底，中国科学院广州生物医药与健康研究院的赖良学研究员团队联合南京大学、广州医药研究总院有限公司等单位，利用CRISPR/Cas9技术率先在犬基因组中实现基因敲除，成功构建出世界首例基因（MSTN）敲除狗“大力神”与“天狗”。四个月时，“大力神”与“天狗”就表现出超强运动能力，且“天狗”还具有明显“双肌”性状。

2016年，赖良学团队与北京希诺谷生物科技有限公司合作，继续犬的基因编辑研究。此次研究的是一个与心血管疾病相关的基因APOE，用于构建心血管疾病动物模型。2016年12月29日世界首例动脉粥样硬化疾病模型犬“苹果”诞生。20天后，另一只APOE基因敲除犬“葫芦”诞生。两只APOE基因敲除犬都表现出血脂、胆固醇升高的症状。

世界首例基因敲除克隆犬

世界首例动脉粥样硬化疾病模型犬“苹果”诞生后，我们就展开对“苹果”体细胞克隆的研究。2017年6月底，公安部南昌警犬基地收到两只比格犬“苹果”和“龙龙”血液样本，经DNA检测发现，“龙龙”与“苹果”同一认定几率大于99.99%，排除与代孕母犬亲子关系。

同时，中国科学院广州生物医药与健康研究院（简称生物院）赖良学研究员团队，对“龙龙”与“苹果”APOE基因进行了鉴定，其基因敲除方式完全一致。这意味着，这两只狗狗应该是同一只！其中一只狗完全由另一只克隆而来——“龙龙”是“苹果”的“翻版”。它不仅是中国首例完全自主培育的体细胞克隆犬，也是世界首例基因编辑克隆犬。

基因敲除克隆犬“龙龙”、“希希”、“诺诺”

基因编辑与克隆技术的完美结合

什么是基因编辑技术呢？基因编辑指能够让人类对目标基因进行“编辑”，实现对特定DNA片段的敲除、敲入等的技术。在过去几年中, 以ZFN (zinc-finger nucleases)和TALEN(transcription activator-like effector nucleases)为代表的序列特异性核酸酶技术以其能够高效率地进行定点基因组编辑, 在基础研究、基因治疗和遗传改良等方面展示出了巨大的潜力。而CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）/Cas9技术自问世以来，就有着其它基因编辑技术无可比拟的优势。

随着技术不断改进，能够在活细胞中“编辑”任何基因的技术中，它更被认为是最有效、最便捷的。研究人员目前已成功在狗、牛、羊、猪、兔、小鼠、大鼠等动物及人类胚胎中实现基因编辑。而说到“克隆”这个词，很多人会想到世界上第一例运用这项技术培育出的动物——克隆羊“多莉”。

克隆羊多莉

“多莉”的诞生，标志着生物体通过体细胞进行无性繁殖的克隆技术成为现实。随后，克隆猪、牛等纷纷问世，克隆犬直至2005年才问世。犬被科学界普遍认为是最难克隆的动物之一。该领域的技术一直被韩国所垄断。而基因编辑与克隆技术相结合，我们认为具有广泛的运用前景。这项技术在品种改良、疾病研究、生物医药等方面都具有巨大的价值。

犬基因编辑与克隆为何如此困难

21年前，克隆羊“多莉”诞生，震动世界。而后，克隆牛、克隆猪等克隆动物，陆续诞生，但对克隆犬，此前却鲜有闻之。克隆犬的首要难题是成熟卵母细胞的获取。

克隆包括三个主要的技术环节：

一是成熟卵母细胞的获取及卵母细胞去核；

二是克隆胚胎制备；

三是克隆胚胎的移植。

成熟卵母细胞的获取有两个途径：

体外成熟培养；

体内成熟获取。

例如猪、牛、羊等动物，可以去屠宰场获取被屠宰牲畜的卵巢，从卵巢的卵泡中取出未成熟的卵母细胞。经体外成熟培养后，并可用于后续的体细胞克隆。犬卵母细胞从卵泡中排出后处于GV期，是未成熟的卵子，需在输卵管中停留48-72小时到达成熟期（MⅡ）。而体外成熟培养效率极低，几乎无法满足克隆需求，因此只能通过体内成熟的方法，获取体内成熟卵子，用于犬的体细胞克隆。

犬的发情周期长达几个月，发情期持续10-15天，但排卵后从卵母细胞成熟到老化的间隔时间较短。因此，获取成熟且质量好的卵母细胞窗口期非常短。这就要求研究人员准确判断犬的排卵及卵子成熟的时间，才能获得处于理想状态的卵子用于克隆胚胎的制备。一旦错过卵子成熟的时间，下次排卵，就要等半年甚至一年。一只狗平均排卵7-8枚，手术取卵时间过早，卵子没有成熟；取卵子时间过晚，卵子又老化。甚至同一只狗也会出现冲出的卵子有的成熟，有的未成熟。正是由于犬的这种特殊生殖生理特点，使得犬基因编辑与体细胞克隆尤其困难。

来源：中科院广州生物院 ，经授权转载。