清华大学，2017国际结构生物学大会现场

整理 | 周瑞、李元元、刘传、程航、万蕊雪、吴申杰

责编 | 陈晓雪

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4月16日，由清华大学结构生物学高精尖创新中心主办的2017国际结构生物学大会在清华大学落幕, 来自美国、英国、日本、韩国和中国的22位科学家做了大会报告。此次大会共有来自各个国家的500多人参加。

会议的主题为“生物大分子：结构、催化和调控”，分成膜蛋白和分子机器、表观遗传学、基因表达与调控、剪接体组装和动态变化、冷冻电镜和核磁共振技术新进展等五个专题进行（会议报告速览见文末）。

诺奖得主、斯坦福大学教授Brian Kobilka介绍了对G蛋白偶联受体在信号转导过程中的各种动态结构变化的研究。另一位诺奖得主、斯克利普斯研究所（The Scripps Research Institute）教授Kurt Wüthrich回顾了核磁共振（NMR）技术从解析简单氨基酸构象到目前用来研究高度动态的蛋白质暂态过程的历程，展示了核磁共振技术在结构生物学中的独特生命力。

清华大学教授施一公和英国剑桥大学MRC分子生物学实验室教授Kiyoshi Nagai分别介绍了利用冷冻电镜技术对剪接体的研究。清华大学教授颜宁报告了关于钠离子通道和钙离子通道的冷冻电镜成果。哈佛大学教授吴皓报告了通过冷冻电镜技术的方法解析的RAG1-RAG2抗体重排蛋白复合体的结构。这些都是非常有挑战性的基础前沿研究，相关突破充分体现了冷冻电镜技术在当代结构生物学研究中的强大生命力。

本次会议的一个特色是结构与功能研究并重。与会演讲者中洛克菲勒大学教授Robert Roeder，哈佛大学教授施扬，首尔大学教授Narry Kim和东京大学教授Mikiko Siomi均为国际知名的功能研究大家。他们的精彩报告充满了发现故事，前沿而有趣，突出了生物大分子功能和结构研究在分子层面的统一。

美国纪念斯隆-凯特琳癌症中心教授Dinshaw Patel表示，会议围绕结构生物学的不同议题为多种前沿的技术和多样化的研究提供了平台。他同时指出，这次会议是中国科学的一次庆典。“在过去几十年，我已经看到了中国科学的发展，尤其是结构生物学的发展。”在会议的闭幕仪式上，Dinshaw Patel说。他盛赞了中国科学在过去几十年的爆发式的发展，高质量的生命科学研究平台已经在中国建立，颜宁、王宏伟、王艳丽等中国科学家的精彩报告已经反映了这一进步。

Patel同时称赞施一公回国对推动中国生命科学的发展起到了关键性的作用，无论是引入终身教职的评审体系，还是聘用大量年轻一代的科学家。“毫无疑问，一公回到清华是中国生命科学的重要转折点。他充满激情与远见，使得中国科学家相信自己能够挑战最高水平的研究。”Patel说。

美国国立卫生研究院资深研究员杨薇曾多次参加在清华大学举办的国际结构生物学大会（其前身为蛋白质科学前沿研讨会）。她指出，能够深切地感受到国内科学的发展，国内科学家报告的内容越来越前沿，水平也越来越高。

Kiyoshi Nagai则表示，这是他第一次参加国际结构生物学大会，前几次他也受到了邀请，但没办法参加。“我真的很享受这次会议。会议非常有意思，水平也高，中国学生真的令人吃惊，他们渴望学习，不惧提问，我很喜欢。” Nagai提到。

Narry Kim也表达了同样的看法。“会议的质量很高，学生们的热情很高，提出不少好问题，这给我留下了深刻的印象。参加这样的会，我觉得很愉快。”

有趣的是，此次报告人中有五位科学家已步入古稀之年，并活跃在科研的一线。其中，Kurt Wüthrich已经79岁，而中国科学技术大学教授施蕴渝、Dinshaw Patel和洛克菲勒大学教授Robert Roeder将在今年先后迎来他们75岁的生日，Peter Wright刚好70岁。

“科学家现在退居二线的年龄要比以前推迟至少10年。”中科院生物物理所饶子和说。他介绍，以Dinshaw Patel为例，2009年被选为美国科学院院士，当时已经67岁，最近几年不断有前沿的成果发表，“而且很多都发在CNS（Cell，Nature和Science的简称）”。

会议最后，Dinshaw Patel鼓励在场的年轻学生投身于科学，“勇敢、无畏地追随你的兴趣，为你们国家的科学发展做出贡献”。

报告速览：

斯坦福大学教授Brian Kobilka主要研究方向为G蛋白偶联受体，并因在G蛋白偶联受体的重要贡献获得了2012的诺贝尔化学奖。G蛋白偶联受体的结构生物学的研究对于研发镇痛剂、安慰剂等药物具有极为重要的意义。

此次会议中，Kobilka介绍了他们团队对G蛋白偶联受体在信号转导过程中的各种动态变化的研究。通过结合荧光共振能量转移、核磁共振、电子顺磁共振等方法探究了G蛋白偶联受体在结合激动剂、抑制剂以及调节剂时跨膜螺旋5和6所发生的构象变化，展示了该蛋白的动态变化。除此之外，他们还通过与下游的信号蛋白上部分肽段共结晶的方法对G蛋白偶联受体结合信号蛋白后的构象变化进行了研究。

►日本东京大学教授Osamu Nureki

日本东京大学教授Osamu Nureki介绍了过去几年解析的转运蛋白的结构。通过脂质立方相结晶（LCP）的方法，Nureki课题组解析了氨基酸转运蛋白YddG的结构，并且发现了结合在活性中心的脂类分子，他们认为这个脂类分子模拟了底物的结合，并对附近的氨基酸进行了突变。通过将蛋白质重组到脂质体活性实验中，检测并确认了活性位点附近的氨基酸突变可以造成转运活性的降低。有趣的是，他们在结构中发现该蛋白呈现出二聚体的形式。通过特异性化学交联的以及计算机动态模拟的方法，Nureki团队确定了二聚体的存在，模拟了二聚体在转运底物过程中发生的构象变化。

►清华大学教授颜宁

清华大学教授颜宁对于钠离子通道以及钙离子通道的研究是此次会议的一大热点。钠离子通道以及钙离子通道在神经兴奋、肌肉收缩以及心脏的正常功能等多个生命过程中发挥着最基础的功能。无论是基础研究还是药物研发，钠离子通道等都是最为广泛的也是最为重要的药物靶点。2012年，颜宁研究组成功解析了细菌中钠离子通道蛋白NavRh的晶体结构，并且通过电生理的实验以及计算机模拟确定了该蛋白质是钠离子通道。2017年，经过几年持续不断的努力，颜宁课题组首次报道了真核生物电压门控钠离子通道3.8 Å（埃）分辨率结构。真核钠离子通道蛋白的获取极为困难，每8升哺乳动物细胞只能表达纯化得到50微克蛋白质。由于蛋白质样品非常有限，最终选择了使用冷冻电镜技术进行结构的解析。另外，颜宁课题组最近两年还先后解析了兔的4.2埃和3.6埃钙离子通道电镜结构。这些研究对于人们了解钠离子通道和钙离子通道的离子选择性以及开发相关药物等具有重要意义。

►哈佛大学医学院教授吴皓

人体免疫系统之所以能够抵御各种外界细菌等侵入，其中一条很重要的原因是可以产生各种各样的抗体。这些抗体的产生与某些区域的DNA通过可变剪接相关。然而介导这些遗传物质发生各式组合的机制尚不清楚。哈佛大学医学院教授吴皓展示了通过冷冻电镜技术解析的RAG1-RAG2蛋白复合体结构，揭示了该蛋白在DNA水平介导抗体重排实现抗体多样性的分子机制。

►纪念斯隆-凯特琳癌症中心教授Christopher Lima

纪念斯隆-凯特琳癌症中心教授Christopher Lima介绍了RNA降解中发挥作用的外切体复合物的结构与功能的研究。

►清华大学教授王宏伟

清华大学教授王宏伟课题组研究的是外切体复合物的结构与功能，他介绍了通过冷冻电镜技术的方法解析了外切体复合物结合RNA的各种状态的结构。

Dinshaw Patel实验室主要应用晶体学、核磁共振方法及冷冻电镜技术来研究生化反应中大分子复合物参与的识别、调控以及催化等反应机理，目前主要研究RNA干扰和组蛋白密码与表观遗传调控机制。

Patel的报告分为两部分。

第一部分介绍了Pistol、Twister等系列核酶（Ribozymes）的晶体结构，他们发现活性中心磷酸根P-O键附近关键碱基的单点突变即可使切割活力几乎完全丧失，展示了核酶RNA的精细三维结构如何进行分子识别和行使酶催化功能的分子机制；

第二部分介绍了V型CRISPR-Cas核酸内切酶“C2c1”与sgRNA（包含crRNA和tracrRNA）和DNA底物复合物以及CPF1与crRNA和DNA底物复合物的晶体结构和切割机制，解释了crRNA介导C2c1使用同一个口袋切割靶向 DNA以及非靶向 DNA的先后顺序和分子机制。此外，Patel研究组还关注病毒反过来抗击细菌宿主CRISPR系统的机制。

►中国科学技术大学施蕴渝

中国科学技术大学施蕴渝课题组主要研究对基因表达过程中表观遗传调控，特别是组蛋白修饰，染色体重塑，组蛋白分子伴侣及非编码RNA，以及非编码RNA与蛋白质的相互作用。

施蕴渝报告了她们课题组新近发现的一类拟南芥RNA结合蛋白APUM23与RNA的结构与功能机制研究。她们发现整个APUM23与RNA的复合物结构呈现类似于英文字母C的形状，APUM23通过多达10个重复模块十分特异性地识别11-mer的单链RNA序列，与18S 核糖体RNA序列高度相似。这个工作揭示APUM23重复模块识别特定RNA序列的分子机制，让人联想到将来利用APUM23重复模块识别切割特定RNA序列的性质，有望像锌指核酸酶一样将APUM23应用于基因编辑。

►哈佛医学院教授施扬

哈佛医学院教授施扬的主要研究方向为染色体和基因转录。10年前，施扬发现了首个组蛋白去甲基化酶LSD1，首次显示组蛋白甲基化修饰也是可逆的。现在LSD1靶向药物研发临床一期将要完成。

施扬报告了RNA 6mA在DNA损伤应激过程中发挥的令人意想不到的作用。RNA 6mA于上世纪七十年代发现，与RNA稳定性和剪接密切相关。该研究工作显示RNA 6mA在促进细胞UV抗性方面的重要作用，并发现了一个新的包括METTL3, RNA 6mA和Pol k在内的在UV引起的DDR反应早期起重要作用的通路。

►斯坦福大学教授Joseph D. Puglisi

斯坦福大学教授Joseph D. Puglisi的报告以“The Choreography of Biological Processes”为题，概述了目前结构研究主要是拍照而不是拍摄电影，无法很好地研究结构动态，生物大分子结构研究不光要研究其动态结构还要研究其组成。通过给tRNA加上各种荧光探针标记，他们团队利用单分子成像生物物理手段，实时监测单个核糖体在翻译延伸循环过程中的动态过程。

►中科院生物物理研究所研究员许瑞明

中科院生物物理研究所研究员许瑞明的报告为未发表工作。

►清华大学医学院教授李海涛

清华大学医学院教授李海涛近年关注组蛋白巴豆酰化等新型酰基化修饰与细胞代谢和基因表达调控等的结构功能。

他报告了研究组近年发现的两类新型组蛋白巴豆酰化修饰读码器，即YEATS结构域和DPF锌指结构域（溴域Bromo则一般不识别）。李海涛2014年报道了YEATS结构域是一类新型组蛋白乙酰化修饰读码器。基于结构分析，他们发现YEATS结构域识别口袋有一个开放的出口来识别长度更长的酰基化修饰类型，如巴豆酰化、丁酰化等。此外，他们还意外地发现DPF锌指结构域蛋白MOZ和DPF也显示出了对组蛋白巴豆酰化修饰显著的偏好性。这些研究工作深化了人们对于组蛋白巴豆酰化修饰和YEATS家族蛋白的表观遗传调控机制。今年年初，李海涛课题组还与合作者共同发现YEATS结构域是急性白血病新型药物靶标，为急性白血病的治疗提供新方向。

美国洛克菲勒大学教授Robert Roeder是真核生物RNA聚合酶I、II、III的发现者，是真核生物基因转录调控研究先驱。2003年拉斯克基础医学奖颁给了Roeder，以表彰他在真核生物基因转录调控研究上所做出的开拓性贡献。

在此次会议上，Robert Roeder介绍了以染色质为模板的转录调控过程中的多个共同激活因子（如组蛋白H3K27去甲基化酶UTX，组蛋白乙酰化酶CBP/p300等）作用的生化分子机制。

►韩国首尔大学教授Narry Kim

RNA tailing是众多RNA修饰中的一种，RNA tailing由一组非经典的聚合酶（PAPs）或末端尿苷酰转移酶（TUTs）催化形成，进而控制着多种RNA的合成、稳定性和活性。韩国首尔大学教授Narry Kim介绍了她们研究组在RNA tailing的调控作用和作用机制的进展。

►东京大学教授Mikiko Siomi

东京大学教授Mikiko Siomi报告了PIWI蛋白Siwi结合内源piRNA的晶体结构，发现Siwi蛋白由N-PAZ和MID-PIWI两个结构域组成，这两个结构域分别结合在piRNA的5’端和3’端。她们的工作对理解piRNA介导的转座沉默机制具有重要的意义。

►美国国立卫生研究院的研究员杨薇

美国国立卫生研究院的研究员杨薇则绍了核酸代谢的一个新范式。

酶催化反应已经被研究了超过一个世纪，并且早在1935年酶催化的中间稳态假说（transition state theory）就已经指出，在反应过程中反应物与处于激发态的中间产物会共存，而酶通过稳定中间态降低活化能从而加速反应的进行。然而直到最近我们才得以真正观察到酶催化反应到底是如何发生的。

借助时间分辨的X-Ray晶体衍射技术以及“晶体原位反应”的手段，杨薇组解析了处于不同反应时间节点的底物-产物的晶体结构，捕捉到了DNA聚合酶催化聚合反应的连续的中间状态，直观地展示了催化反应的进行磷酸二酯键是如何逐渐形成的。

此外杨薇组还在一系列的反应中间态中发现了第三个二价金属离子的电子密度，这颠覆了长期以来人们普遍接受的核酸酶催化反应的Two-metal-ion机制。通过时间分辨的X-Ray晶体衍射技术杨薇组发现晶体结构中第三个金属离子的电子密度随着反应温度的上升而增强，进一步验证了这一设想。

►复旦大学教授徐彦辉

复旦大学教授徐彦辉报告了DNA甲基化动态调控的结构基础。

DNA甲基化是一种十分重要的表观遗传修饰，TET蛋白是一类与DNA去甲基化相关的蛋白，它能将5-甲基胞嘧啶（5mC）依次氧化成5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）、 5-醛基胞嘧啶（5fC）以及5-羧基胞嘧啶（5caC）。徐彦辉组发现人的TET1/TET2蛋白对5mC-DNA的活性远高于5hmC/5fC-DNA。这表明TET蛋白对于体内DNA的5mC氧化的调控有着重要的作用。为了研究TET蛋白对5mC-DNA底物的偏好的机制，徐彦辉组解析了TET2-5hmC-DNA以及TET2-5fC-DNA复合物的晶体结构。除了TET蛋白，在体内还有一类DNA甲基转移酶DNMT3A/DNMT3B与胚胎的基因组甲基化密切相关。徐彦辉组也解析了处于自抑制状态的DNMT3A-DNMT3L以及处于活化状态的DNMT3A-DNMT3L-H3晶体结构，发现ADD domain通过与催化结构域相互作用阻断了催化结构域与DNA底物的结合，而组蛋白H3则破坏了这种相互作用，并使ADD domain产生了很大的转动，从而解除了DNMT3A的自抑制。

►中科院生物物理所研究员王艳丽

中科院生物物理所研究员王艳丽介绍了CRISPR-Cas 介导的外源核酸的切割研究。细菌在遭遇噬菌体入侵时会将外源的DNA片段整合到宿主的CRISPR位点形成一个新的间隔，借助这种机制细菌得以对噬菌体入侵产生“记忆”。

2015年，王艳丽组揭示了CRISPR-Cas系统特异性选择protospacer以及决定其长度的机制。C2c2是VI型CRISPR-Cas系统的effector，它有两种RNA酶活性，既能切割pre-crRNA又能处理目标RNA。

2017年，王艳丽组报道了C2c2自身以及结合crRNA的两种状态的晶体结构，发现C2c2的两个活性位点分别位于两个在空间上相距甚远的结构域（helical-1 & HEPN domain），并且crRNA的结合会引发C2c2发生显著的构象变化，而这种构象变化进一步稳定了crRNA的结合，同时还促进了C2c2对目标RNA的识别。

此外，王艳丽组还解析了C2c1-sgRNA复合物的晶体结构，揭示了C2c1高度特异地切割DNA的机制。

清华大学教授施一公针对剪接体对前体信使RNA剪接作用的工作机理做了精彩报告。

施一公首先回顾了信使RNA剪接现象以及剪接体的发现及机理探索的研究历史，指出解析高分辨率完整剪接体三维结构对推动这一领域的重要性。

紧接着，施一公介绍了于2015年解析的世界上第一个近原子分辨率的完整剪接体结构——裂殖酵母（S. pombe）剪接体总体分辨率达3.6埃的冷冻电镜三维结构。这一结构清晰的展示了由37个蛋白质分子及包括前体信使RNA内含子套索结构在内的4条RNA分子共同组成的超复杂的剪接体分子机器的三维结构，揭示了由U2、U6以及U5 snRNA所构成的剪接体催化反应中心，并且首次观察到剪接体的两个亚复合物——nineteen complex（NTC）以及nineteen complex related（NTR）的组成结构，由此说明这两个复合物在协助催化反应中心形成和稳定这一方面起到不可替代的重要作用。

随后，施一公对酿酒酵母体内另外4个重要工作状态下的剪接体三维结构进行了介绍，它们分别是：

① 酿酒酵母（S. cerevisiae）剪接体组装过程中的重要复合物U4/U6.U5 三小核核糖核蛋白复合物（U4/U6.U5 tri-snRNP）总体分辨率为3.8埃的三维结构；

②酿酒酵母体内代表着激活状态下的剪接体（activated spliceosome，又称为Bact complex）总体分辨率为3.5埃的三维结构；

③酿酒酵母体内代表着第一步反应后的剪接体（catalytic step I spliceosome，又称为C complex）总体分辨率为3.4埃的三维结构；

④酿酒酵母体内代表濒临第二步反应前催化激活状态的剪接体（step II catalytically activated  spliceosome，又称为C* complex）总体分辨率为4.0埃的三维结构。

通过对如上几个剪接体工作状态的结构分析，施一公指出，剪接体是一个金属离子介导的核酶，由RNA行驶催化信使RNA剪接作用的功能，其中的蛋白质组分的主要功能是稳定或提供柔性从而帮助剪接体在恰当时机进行构象变化从而推动反应进行；另一个重要的发现是，位于剪接体中心的剪接催化反应中心一经形成，构象便基本不再发生变化。

施一公还指出，剪接体内有大约20个蛋白及核酸组分从第一步剪接反应前到剪接体解聚前构象完全不变，这20个组分组成了剪接体的刚性核心。

►英国MRC分子生物学实验室教授Kiyoshi Nagai

英国剑桥大学MRC分子生物学实验室教授Kiyoshi Nagai报告了对近年来剪接体的冷冻电镜结构的研究，并分享了他对剪接体催化机理的理解。

Kiyoshi Nagai由前体信使RNA内含子序列的去除需要两步化学转酯反应引入，随后简要回顾了剪接体的纯化策略，详细介绍了第一步反应后剪接体（C complex）三维结构的解析过程和结构分析。

接下来，Nagai着重对第二步反应前剪接体（C* complex）的三维结构以及剪接体中包括前体信使RNA在内的4条RNA分子的构象变化进行了分析，详细介绍了第一步转酯反应后至第二步反应前RNA分子的位置以及它们是如何被稳定在特定构象中的，并且由此推测了在两步反应的转换过程中起重要作用的ATPase Prp16蛋白的工作机理。

最后，Nagai对比和分析了U4/U6.U5 tri-snRNP、Bact complex、C complex以及C* complex的三维结构，指出剪接体的本质是一个核酶，其两步转酯反应是由同一个活性位点催化完成的；剪接体的催化核心在B complex向Bact complex转换的过程中形成，之后这个催化核心一直被Prp8、NTC、NTR等蛋白分子固定并且保持构象不变；信使RNA底物相关位点进入反应中心是由ATPase调节的，也因此，剪接体是一个由ATP提供能量推动的分子机器。

最后两位报告人均为美国斯克利普斯研究所的核磁共振技术专家： Kurt Wüthrich和Peter E. Wright。

►美国斯克利普斯研究所教授Kurt Wüthrich

Kurt Wüthrich是发展核磁共振技术解析生物大分子的开创者，并因此获得了2002诺贝尔化学奖。Wüthrich酷爱运动，语言风趣幽默，在讲演开头为大家展示了他在足球场上英姿飒爽的照片。2015年的《自然》杂志上，更是刊登了他年轻时跳高时矫健的身姿。Wüthrich鼓励大家说道：“在座的年轻人都希望能够在顶级科研期刊上发表工作，获得诺贝尔奖，那么不如首先走出实验室，锻炼出一副健康的体格！” 

将近两百年前，英国植物学家R.布朗就利用显微镜观察到了花粉颗粒在水溶液中的无序、不停歇运动，这种现象也因此被称作“布朗运动”。随后，伟大的物理学家爱因斯坦在理论上推导证明了水分子的热运动是造成布朗运动的分子机制。相比于蛋白质X-射线晶体学和目前发展如火如荼的冷冻电镜技术，蛋白质的核磁共振技术可以在室温接近生理温度的条件下，直接在水溶液的环境中来观测生物大分子的动态变化。Kurt Wüthrich回顾了核磁共振技术从解析简单氨基酸构象到目前利用核磁共振技术研究高度动态的蛋白质暂态过程的历程，展示了核磁共振技术在结构生物学中的独特生命力。

►美国斯克利普斯研究所教授Peter Wright

Peter Wright的研究同样精彩。在纷繁复杂的蛋白质王国中，有一类看似“垃圾”的蛋白质：固有无序蛋白质（Intrinsic Disordered Protein, IDP）。和我们通常理解的具有规则、稳定的三维空间结构的蛋白质不同，IDP并没有固定的三维结构，呈现一种线性的无序状态。可想而知，IDP蛋白的研究是冷冻电镜和X-射线晶体学难以处理的，而核磁共振技术在这里表现出了不可比拟的巨大优势。Wright详细介绍了其研究组利用核磁共振技术探究了一类在细胞缺氧反应（hypoxia）中著名的HIF1蛋白中一段固有无序结构和其他蛋白CITED2和TAZ1之间竞争性结合的有趣现象：CITED2可以不可逆地替换掉和HIF1蛋白相互作用的TAZ1。

制版编辑：邓志英丨