撰文 | 饶毅

多样性与自然选择是生物演化的核心规律。

多样性与选择也是免疫学的核心概念之一。

免疫学的发展，不仅带来了对基本原理的理解，在分子水平揭示了美妙的自然规律，而且建立了对生物学研究和医学实践有用的技术，改善了人类的健康、推动了人类的进步。

免疫与危害动植物的感染密切相关。动植物识别和排除抗原性异物，应对外界病原菌、污染物和体内疾病等，参与监控清除自身变异成分（肿瘤、衰老和死亡细胞）。免疫分为先天性免疫和获得性免疫。先天性免疫又称非特异性免疫（innate immunity或nonspecific immunity）是在长期进化过程中形成，并具有遗传特性，生来具有的功能免疫；获得性免疫又称特异性免疫（acquired immunity or specific immunity），是后天感染抗原性异物，或人工接种物（如疫苗和异物等）而使机体获得，针对病原体的抵抗能力。哺乳类动物中有特异的淋巴细胞分别介导体液免疫和细胞免疫。体液免疫的B淋巴细胞产生抗原相对应的抗体，来达到保护生物体的免疫机制。面对自然界如此繁多的抗原性物质，个体生物可以产生直接与抗原结合，多于10¹¹种类的蛋白抗体分子，被称之为抗体的多样性。

免疫学研究源于人类希望抵抗传染病，也与人类对输血的实际需求有关。经过迷信、迷惑、试错等多个阶段，步履艰难、甚至犯过错误，坚持探索的严肃研究者逐渐从现象到本质，到1898年确定：抵抗传染病和输血涉及相同的核心问题——免疫。对免疫的机理，从1900年诞生侧链学说后不断修改，1957年出现克隆选择学说，1960年代理解抗体蛋白质的结构，1970年代理解编码抗体的DNA有特殊的重组机制逐步解析抗体多样性产生的机理。

天花的预防

在两千五百年前，古希腊历史学家Thucydides（460-400 BC）记录了雅典的传染病，患病痊愈者一般不再发病、如果发病也轻于初发者。基督教曾把这种差别归因于上帝，把第一次就不生病者（我们今天知道是天然免疫者）认为是无罪者，而患病痊愈者（后天免疫者）当成洗清了罪恶。在欧洲所谓中世纪的阶段，阿拉伯世界和伊斯兰地区的科学发展，改变了人类对传染病和免疫的宗教和迷信看法。

天花（variola, small pox）可能有上万年的历史（Riedel，2005）：在公元前一千年前的埃及木乃伊上留下了天花的痕迹，中国也在公元前1122年就有天花的记载，欧洲在5世纪到7世纪间开始有天花。天花曾肆虐世界，死亡率高、不死也留下失明或脸上疤痕等后遗症。18世纪欧洲天花感染率非常高，接近全部群居人口，占儿童死亡率的三分之一。

人们很早知道已患过天花的人不会再患天花。在世界上多个地区曾出现用天花病人的少量液体接种给健康人，使后者获得免疫力。这一方法也有人告诉欧洲，但未获推广。英国驻奥斯曼帝国大使蒙太古夫人（Mary Wortley Montague，1689-1762）于1717年在伊斯坦布尔根据当地流传的方法，请使馆医生Charles Maitland（1668-1748）监督给自己儿子接种少量天花（Downie，1951）。她们回英国后，她请Maitland再给女儿接种，Maitland要求有六个医生在场。成功后，其中一位医生要求给自己的儿子接种。英国还用犯人和孤儿做过试验，让皇后放心后，她再要求给王子接种，这样逐渐传开。接种少量天花既可能有效，也可能导致天花发病。

1774年，英国农民Benjamin Jesty（1737-1816）用挤奶女工的牛痘接种于其妻子和两个儿子，成功地避免了他们患天花（Pead，2003），但他没发表文章。乡村医生Edward Jenner（1749-1823）有相当的科学基础，1787年确定杜鹃的行为而于1789年入选皇家学会。1796年5月14日，他从挤奶女工Sarah Nelmes手上取得牛痘接种给8岁的男孩James Phipps（1788-1853），六周后接种少量天花，Phipps完全不被感染，证明牛痘诱导免疫的成功。Jenner并非第一位接种牛痘者，但他第一位正式报道牛痘接种的方法。1798年，Jenner总结了自己接种病例以及通过访问得到的一些回顾性病例，共23例发表专著（Jenner，1798），1799再加例子，到1801年英国有逾六百例（Jenner，1801）。Jenner还区分了真的牛痘和假的牛痘，从假牛痘获得的材料不能有效地引起对天花的免疫，真牛痘才能保证成功地诱发免疫。Jenner称牛痘为Variolae vaccinae（牛的天花），用牛痘接种导致人对人的天花免疫就被称为vaccine。Jenner当时有一个错误，认为牛的天花来自马的炎症，但他对牛痘接种的方法做出了不可磨灭的贡献。

免疫学的发展与微生物学相关。十九世纪，法国化学家巴斯德（Louis Pasteur, 1822-1895）和德国医生科霍（Robert Koch，1843-1910）为代表的科学家们证明传染病的病原菌学说，建立培养细菌的方法，发现重要的致病菌，发明多种传染病的疫苗（炭疽病和鸡霍乱疫苗等）（Pasteur, 1881），推动了免疫学的发展。巴斯德把原来词根为牛的vaccine推广为广义的疫苗（Baxby，1999）。

接种疫苗后，人获得免疫力的原理是什么？巴斯德曾认为是第一次感染过程中细菌耗尽了体内对细菌生长需要的营养成分，所以细菌不能再感染同一个人，该个体从而产生免疫力。

抗血清的发现

先天免疫的发现归功于俄国科学家Élie Metchnikoff（1845-1916）在俄国和法国进行的研究。Metchnikoff最早在其比较病理学研究中发现吞噬细胞的作用（Metchnikoff，1884，1901,1905; Tauber, 2003）。

体液免疫研究源于德国。1888年，法国细菌学家Emile Roux（1853-1933）和旅法瑞士细菌学家Alexandre Yersin（1863-1943）发现白喉毒素是白喉杆菌致病的原因。1889年Koch实验室的北里柴三郎（Shibasaburo Kitasato，1853-1931）发现破伤风毒素是破伤风杆菌致病的原因。毒素研究风靡一时的情况下， Koch曾误认为结核菌素（tuberculin）是结核杆菌治病的原因。

1890年，Koch研究所的Emil Adolf Behring（1854-1917）和北里柴三郎发表“动物对白喉和破伤风免疫的机理”一文，报道了白喉毒素的抗毒素和破伤风毒素的抗毒素（Behring and Kitasato，1890），证明在不含细胞的血清中有免疫作用的物质。Behring主要做白喉、北里做破伤风的抗毒素，他们获得的抗血清既能治疗已感染的动物，也能预防健康动物被感染。在Behring和北里之前，除了细胞免疫之外，免疫的原因认为是因为血液有杀菌能力、或动物适应了毒素、或动物在接种后发生了化学变化使其体液和组织不利于微生物生长。Behring用大鼠进行的白喉研究不支持以上解释，而提出免疫后动物的血液可以中和白喉毒素，这一结论在北里的破伤风毒素研究得到进一步支持和推广。

Behring和北里报道的破伤风实验既用过破伤风杆菌、也用过破伤风毒素作为免疫原，用低于导致疾病的剂量注射给兔，诱发兔的免疫，被注射后的兔对再感染或破伤风毒素有20倍的抵抗力。从有免疫力的兔的颈动脉获取血，注射给小鼠的腹腔，得到的两只小鼠与未被免疫兔血注射的两只小鼠比较。后者在破伤风杆菌注射后分别于20小时、36小时死亡，而免疫兔血注射过的小鼠健康生存。如果免疫的兔血凝结，其上清也就是血清。以免疫的兔血清注射6只小鼠的腹腔，24小时后他们再被破伤风杆菌感染不会生病，而对照小鼠48小时死亡。以上实验显示免疫的血清可以让正常动物对感染的抵抗力增加，有预防作用。他们还将抗血清与可以感染小鼠的破伤风杆菌同时注射的动物，也提高后者的生存。他们认为这是治疗作用。一旦获得抗血清，无论预防式、还是治疗式，小鼠长期免疫。作为对照，非免疫的兔血清，没有这些作用。他们不仅用了兔，还用过牛、马和羊。

Behring和北里的文章清晰地表明血清中含有对抗毒素的物质：破伤风免疫后的兔血可以中和破伤风毒素；这一作用存在于无细胞的血清中；将免疫动物的血清转入其他动物可以继续发挥作用；未经免疫的动物不具有消灭破伤风毒素的能力（Behring and Kitasato，1890）。这篇文章开创了体液免疫。

一周后在同一刊物，Behring单独发表了有关动物对白喉免疫力的论文（Behring，1890），补充第一篇文章的破伤风毒素。他显示动物的血液也可以产生对白喉毒素的免疫力。Behring单独的这篇文章未用抗血清一词，不如两人合作的抗破伤风毒素的文章。

当时也在Koch研究所工作的Paul Ehrlich（1854-1919）也研究了抗毒素。Ehrlich发现了两种植物蛋白质（蓖麻毒素（ricin）和相思子毒素（abrin））的抗毒素（Ehrlich，1891b）。他先给鼠低剂量的蓖麻毒素，逐渐增加剂量，前五天没有变化，第六天鼠对蓖麻毒素的耐受力大大提高（蓖麻毒素的致死剂量提高到最初的13倍），其后可以逐渐增加，但不能超过1000倍。主动免疫延续的时间长于6个月。与白喉和破伤风抗毒素一样，产生了抗毒素的动物之血液可以输给其他的动物而使之产生被动免疫。被动免疫时间远短于主动免疫，但他没有确定具体时间。同样，他发现相思子毒素可以诱导免疫。两种免疫都是特异的，没有交叉，他提出不同毒素诱导的抗体是不同的。1892年，Ehrlich发表“免疫的遗传和吮乳”一文，揭示新生鼠含母亲来源的抗体，提示抗体可以传过胎盘到达胎儿，而出生后的婴儿还可以通过母乳再得到抗体，婴儿的消化道不同于成人，没有破坏抗体，而可以吸收抗体进血液（Ehrlich，1892）。

因为效率不高、变异较大，Behring的抗白喉血清产量不稳定，用其方法的工厂（Hoechst）难以获得高效价的抗血清。Ehrlich的抗蓖麻毒素抗血清和抗相思子毒素抗血清有较高效价，而且Ehrlich检测方法的定量化较好。在Behring邀请、Koch支持下， Ehrlich于1892年加入改进抗白喉抗血清和抗破伤风抗血清的生产。1894年Ehrlich等发表了“白喉抗血清的生产和应用”（Ehrlich，Kossel，Wassermann，1894）。他们的改进包括：用山羊（和牛）产生抗体；通过先用低剂量后增加剂量获得高效价抗体；用标准制备的毒素在体外检测抗血清中和毒素的比率，检测抗血清的效价（“免疫单位”）。他们制备的抗血清很稳定，临床治疗效果很好。他们还发现可以用山羊的乳汁获得抗体，也有效果。血清含量是乳汁的20倍左右，但一天可获30升乳汁，相当于约1.5升的血。

1896年，普鲁士教育部长请Ehrlich建立“血清研究和检测研究所”。Ehrlich费很大精力标准化白喉抗血清的检测方法。Ehrlich首先将毒素和抗毒素的作用视为化分子之间的相互作用（Ehrlich，1885，1897）：一个毒素分子与特定的不可改变量的抗体相结合（Ehrlich， 1897）。Ehrlich称抗血清中起作用的分子为抗体（antikörper，antibody）（Ehrlich，1897）。

对传染病的预防和治疗需求是人类开始免疫学的一条主线。另一条是对输血的需求。

输血：愿望和困境

有关血液，人类流传很多不同看法、不乏浮想联翩。所谓血型与性格的关系，长期流传而缺乏证据。所谓放血疗法，历史上常有人推广而缺乏有效性的证据。

十九世纪，人类理解血液由细胞和血清两部分组成。血清中含多种分子。红细胞运输氧气，白细胞有粒细胞（中性、嗜酸性、嗜碱性粒细胞）、吞噬细胞、肥大细胞、淋巴细胞等多种起防卫机体的作用（Ehrlich，1878；Ehrlich，1891a；Ehrlich and Lazarus,1898），血小板通过凝结起封闭破裂血管的作用。缺血、或缺乏血液的特定成分可导致人类疾病。

人类从很早开始希望输血、或补充血液中特定成分，但不同时期遇到不同的实际困难。在不懂免疫学之前，输血有很大危险。1901年，ABO血型的发现根本地改变了输血的安全性，在第一次世界大战开始成规模应用，现在全世界几万所医院每年进行数以百万至千万次输血，挽救了无数人的生命。

有争议的传说教皇无辜八世（Pope Innocent VIII, 原名Giovanni Battista Cybo，1432-1492）半昏迷后，医生曾安排他与三位十岁的男孩换血，四人都去世。1656年，英国建筑家、科学家Christopher Wren（1632-1723）给狗注射过红酒和啤酒（Maluf, 1954），1663年他和Robert Boyle（1627-1691）给狗进行静脉注射，虽然他们注射的是诸如酒和鸦片，也奠定了输血的基本技术（Learoyd，2012a）。1665年2月，英国医生Richard Lower（1631-1691）在两只狗之间输血（Lower，1666a，1666b；Maluf, 1954）。1667年6月15日，法国路易十四的御医Jean-Baptise Denys（1643-1704）把12盎司的羊血输给15岁的男孩，第二例是输给劳工，两人都活下来了。第三例是瑞典男爵Gustaf Bonde（1620-1667），在接受第二次羊血后去世。

当时并不知道血液的功能，一方面氧气尚未发现，另一方面还相信血与性格的关系。1667年11月23日， Lower和Edmund King（1630-1709）在皇家学会将羊血输给Arthur Coga（Lower and King，1667），目的是为了改善其头脑“太热”，所以用温顺动物（绵羊）的血（Maluf，1954）。法国Denys医生用的第四例是经常离家出走的疯子Antoine Mauroy，其主人和妻子先后要求Denys输小牛的血改变他，后来死亡（Maluf，1954）。这些做法以后当然被质疑。

输血的安全性明显有问题，法国、英国、教皇都禁止输血近150年。在不懂血液功能、不懂消毒、不懂免疫的多重无知的情况下，输血必定难以成功。

虽然十八世纪还有各种传闻和不完备的记载，包括Eramus Darwin（1731-1802）曾设计过输血的仪器，它不是输血的热门时期。但十八世纪的科学奠定了输血的基本知识。英国的Joseph Priestley（1733-1804）和法国的Antoine Lavoisier（1743-1794）发现氧气及其功能，以后才能理解血液给全身输送氧气的作用。从1242年阿拉伯学者Ibn al-Nafis（1213-1288）到1628年英国的William Harvey（1578-1657），人类终于理解了血液循环，明确心脏与血流的关系、血流的方向（Harvey，1628），澄清此前认为血液无方向弥散全身等错误观点。

十九世纪，英国妇产科医生James Blundell（1790-1878）进行了第一次有确切记载的人与人之间输血。鉴于产后出血常常导致死亡的危害，他提出输血有益。1818年，他先用动物做实验，让狗放血后，再注射来自动物的血液。他证明不同种动物之间输血导致死亡（但在狗的血完全放完后，输入羊血，狗可以恢复好几天之后再死亡）（Blundell，1818）。他也发现血液不能在体外保存太长时间（低于30秒）。他还证明给动物输来源于其自体的血是安全的，而且血液通过他发明的仪器重新回到动物体内是安全的。他实验了输血过程需要防止混入气泡导致的血管阻塞。1818年12月22日，在其他医生要求下，他给一位濒临死亡的胃癌患者输了来自几位自愿者的血，状态有好转后两天还是去世了（Blundell，1819）。1818年至1825年，他试过6例输血，都不成功。1825年，他与Charles Waller (1802-1862)和Edward Doubleday（1799-1882）成功地给产后失血昏迷的妇女进行输血，并挽救她们的生命，其中第一例的血来自患者的丈夫，有些来自医护人员（Doubleday, 1825; Waller, 1825; Dzik, 2018）。他还发明和比较了几种输血仪器（Blundell，1824，1829b）。输血危险性和不确定性仍然很明显。

1869年，德国哥廷根大学生理研究所的医学生Adolf Creite（1847-1921）发表他的观察和实验结果。在法国Claude Bernard（1859）发现狗血清注射到兔导致兔出现血尿的基础上，Creite给兔分别注射约8毫升的小牛、猪、狗、羊、猫、鸡、鸭、或山羊血清，接受其中后5种血清注射后，兔的尿中出现血、生病、死亡。他猜想是血清所含蛋白质导致兔的血尿。他进一步实验，加热处理血清，出现的蛋白质凝聚物被过滤之后，再注射给兔，就不会有血尿和死亡。因此，他提出血清蛋白质导致接受输血的动物红细胞溶解。体内实验后，他还进行了体外实验，将兔血与其他动物的血清混合，发现红细胞凝集现象。他在体外也观察到了红细胞溶解、但对其重要性不甚明确（Creite，1869；Hughes-Jones and Gardner，2002）。

德国病理学家Emile Ponfick（1844-1913）于1874年向波罗的海医生协会报告：一位34岁妇女死于输羊血，他称病理解剖发现其血含溶解的红细胞。1875年，Ponfick通过羊对狗输血证明羊的红细胞溶解、尿液含血红蛋白（血红蛋白尿），他进一步证明狗的血红蛋白尿来自羊，因为如果只注射羊的血清、而不是全血，狗就不会有血红蛋白尿（Ponfick，1875）。

1875年，德国生理学家Leonard Landois（1837-1902）出版了358页的专著《输血》，总结了1667年至1874年的478例输血。其中129例输动物血给人，原作者号称42例后患者有所改善，62例没有改善，25例暂时改善但不可靠。347例人对人输血，150例“改善”，180例不佳，12例不明，3例结果未知，2例在输血过程中去世（Landois，1875；Maluf，1954）。他在体外显微镜研究八种动物血清对其他动物红细胞的作用，观察到一种的动物血清导致另一种动物红细胞溶血和凝集作用（Landois，1875；Hughes-Jones and Gardner，2002）。

1894年，在Koch研究所工作的Richard Pfeiffer （1858-1945）发现“Pfeiffer现象”：将霍乱弧菌注射到对霍乱有免疫力的豚鼠或兔的腹腔，霍乱弧菌会变形然后溶解；如果将霍乱弧菌与少量对霍乱免疫的血清注射到对霍乱没有免疫力动物的腹腔，霍乱弧菌也会被溶解（bacteriolysis）（Pfeiffer，1894）。当时Pfeiffer认为这种现象只能在动物体内发生，而在法国巴斯德研究所的Metchnikoff证明在体外也一样发生（Metchnikoff，1895）。1895年，在Metchnikoff实验室工作的比利时科学家Jules Bordet（1870-1961）发现霍乱弧菌在抗血清作用下出现凝集现象（Bordet，1895）。维也纳大学的Max von Gruber（1853-1927）发现抗血清对霍乱和伤寒杆菌的凝集作用（Gruber and Durham，1896）。

1898年， Bordet在体外观察到一种动物血清一般都能导致另外一种动物的红细胞凝集，例如鸡血清可凝集大鼠和兔的红细胞。异种动物血清也可以溶解红细胞（如兔血清溶解豚鼠红细胞），导致其内含血红蛋白外泄。55oC加热处理血清可以灭活其溶血作用，但不影响其凝集作用。血清对红细胞的溶血和凝集作用，与血清对细菌的作用很像，而且这两种作用依赖的血清内物质对热的敏感也类似，所以Bordet提出血清中影响红细胞的物质与血清中对抗细菌（如霍乱菌）的物质类似。因此，Bordet的研究不仅明确血清对红细胞的两种作用，而且提出血清抗异种动物红细胞的机理类似于血清抗病原菌的机理（Bordet，1898，1899）。

Bordet的概念很快被接受。

Ehrlich指出：“很可能溶血的机理与溶菌的机理非常相似。因此溶血的研究就有相当的理论意义”（Ehrlich and Morgenroth，1899）。而且Ehrlich与Julius Morgenroth（1871-1924）合作研究溶血，在1899年和1900年发表六篇“溶血”的研究论文（如：Ehrlich and Morgenroth，1899，1900a，1900b）。

从古代将输血作为一个特殊问题，到19世纪末科学家终于确定输血问题也是免疫问题。

血型：突破

因为Creite（1869）发现体外可以观察血清导致红细胞溶解和凝集、Landois（1875）进一步使用体外红细胞凝集和溶解的方法，实质上建立了体外血型检验的方法学。Bordet（1898，1899）提出血清对细菌和红细胞的作用类似而将红细胞的血型分析明确纳入免疫学。

也就是说，十九世纪末，已经出现大部分有关输血的技术和科学基础，但缺一关键：血型及其匹配。也是一种“万事俱备，只欠东风”。

1900和1901年，奥地利维也纳大学病理解剖研究所的Karl Landsteiner（1868-1943）发现了人类的血型。检测血型的方法非常简便而实用。今天我们知道有26种主要血型，至少270种不同红细胞表型，Landsteiner发现了对输血影响最大的ABO血型和Rh血型。

既然之前无人知道血型，Landsteiner不可能是为了发现血型而研究血液，而且他也不是为了输血而研究血型。1900年，他先用动物研究胰蛋白酶形成抗体，希望通过抗体来研究当时化学不能区分的蛋白质差异，他也研究了牛血清对豚鼠红细胞的沉淀和凝集作用。他用碳酸或硫酸铵沉淀牛血清，将血清分成被碳酸所沉淀出来的球蛋白部分和其他部分。将溶液的氯化钠浓度调到0.6%之后，可以溶解球蛋白。Landsteiner用豚鼠红细胞来比较牛血清的球蛋白部分和非球蛋白部分的凝集作用，发现球蛋白作用强于其他部分。他也比较了球蛋白部分和非球蛋白部分对红细胞的溶解作用，发现两者没有差别。在此过程中，他有其他观察，他加在论文的注脚中：“健康人的血液可以凝集动物的红细胞，而且不同人的血液也可以凝集其他人的红细胞。不清楚这样现象是否源于个体差异、还是损失或细菌感染影响。重病人的血清这一现象更明显。这一现象也许与1892年Maragliano发现的血清可以溶解多种疾病患者红细胞的现象有关”（Landsteiner，1900）。

1900年的注脚成为1901年研究的起点（Landsteiner，1901）。Landsteiner首先澄清自己的研究与Maragliano（1892）不同，最大的差别在于Maragliano观察到的溶血在同一个人的体内发生，可能与疾病有关，而Landsteiner发现的红细胞凝集和溶血只在不同个体的人之间发生。按Ehrlich and Morgenroth（1900a）的定义，Landsteiner指出自己研究的也是同种异体的凝集素和溶血素（isoagglutinins和isolysins）。他用三张表列出了做体外凝集实验的结果，含6位成年男性之间、6位产后女性之间、5位产后女性和6个胎盘的红细胞之间的结果，另外还做了10位成人，其结果与表格显示的一致。

表一可见，Sturli和Landsteiner本人（L）的红细胞不会被其他五位的血清所凝集；Pletsching和Z两位互相不凝集，也不凝集Sturli和L，但凝集Sturli和E；Sturli和E也互相不凝集，不凝集Sturli和L，但凝集Pletsching和Z。所以六位成年男性按红细胞凝集情况可以分成三组。

表二可见，六位产后女性也分成三组：Linsm不与其他五位发生凝集；Seil、Mittelb和Tomsch三位互相不凝集，也不凝集Linsm，但凝集Lust和Graupn；Lust和Graupn也互相不凝集，不凝集Linsm，但凝集Seil、Mittelb和Tomsch。

表三可见，产后女性的血清与胎盘的红细胞在凝集反应中，就不如以上这么简单。Landsteiner提出以前Halban就发现婴儿血清在凝集反应也常常阴性。Josef Halban（1870-1937）是维也纳大学的妇产科医生，他读过1900年Landsteiner文章的注脚后，用产妇和婴儿的血做过凝集实验（Halban，1900）。

Landsteiner提出不考虑胎盘的红细胞结果，可以看到成人血清和红细胞的凝集反应呈三类：A、B、C。他将对其他不起反应的称为C，另外两类为A和B。当时所谓的C型，他后来改称O型。他没有交叉检测六位男性和六位女性，所以并不确切知道男性的三类与女性的三类是否相同。他用的人数太少，所以没有发现AB型。

文章结尾指出：“最后，不妨提到这些观察可能协助解释治疗性输血的各种后果”。

Landsteiner（1901）的研究相当简单，但意义重大。基本技术非他发明，他是应用已有技术，但他有想法。实验的操作也很简单，不需要实验高手。实验需要的时间也很短，一周做几十人恐怕很容易，一天做几十人也并非难事。说明：在生物学，有时候，想法也比技术、手段、努力要更重要。

当时为什么没有其他人用同样方法研究血型？在他之前，已知不同个人之间输血有问题，在一定程度上等于已经用输血来体内检测个体差异，但没有科学家用体外实验检验不同个体来源的血清和红细胞之间的反应。与Landsteiner研究最接近的是回到比利时的Bordet以及德国的Ehrlich和Morgenroth。Bordet在Landsteiner之前已经做了很多体外血清和红细胞的溶解和凝集反应，而Ehrlich和Morgenroth接连发表了六篇体外血清和红细胞的溶解和凝集反应，每一篇都比Landsteiner（1901）的长。Ehrlich和Morgenroth当时集中探寻免疫的规律，特别是“侧链学说”，可能忽视了从实验设计和操作上都更容易解决的血型分析和匹配问题。在知道Landsteiner（1901）结果后，Ehrlich持反对态度：人为什么有个体间的免疫反应？其他人不是病原菌，一个人用不着通过免疫系统对付其他人。这个问题当然不是Landsteiner带来的，因为早就知道人对人输血经常不成功，虽然以前可有多种如操作不当、血液保存不妥等其他非免疫的原因，但到了1900年，应该可以提出个体间的差异导致的免疫反应是输血困难的原因之一。但是，Ehrlich问题的简化版：为什么一个人在生理上要有机制破坏另一人的红细胞？两个人的血从来不见面，自然界设计这种机理岂非多此一举？这种问题确实不好回答，其答案的提示在Landsteiner的表3（虽然当时他自己也不知道表3的意义）和本章的第6节（免疫耐受），问题需要反过来思考：为什么一个人的免疫系统不攻击自己，只攻击其他？

1900年Landsteiner的课题并非血清与红细胞的关系，他最初试图用血清来检测蛋白质的特征（包括来自不同动物种属的同一蛋白质的差别）。他在1900年的注脚，燃起了自己的兴趣，很快用简单的实验揭示了血型的规律，而且立即提供了可以用于临床实践的方法。但他那时研究并不如Bordet、Ehrlich、Morgenroth等。他的研究核心在想法，而实验方法是已有的，而且很简单。他只研究了二十几个人，结论主要依赖12人。表1的六位成年男性属于三类血型（两位O型、两位A型、两位B型），表2的六成年位女性也属于三类（一位O型、三位A型、两位B型）。这种数据在统计上也不典型。当然他说还做了10位，结果与此类似。但应该做几十例、上百例，才能确定大概多少类。因为实验的简便性，只能推测他实验设计有欠缺，而没有花一、两个月的时间做几百例。

血型：从基础回应用

Landsteiner的样本量太少，只发现了ABO 血型的A、B和O。1902年，他的学生Adriano Sturli（1873-1964）与维也纳大学第二医学诊所的实习医生Alfred von Decastello（1872-1960）合作研究了155人（121位病人、34位常人），他们发现其中4人很特别，他们的血清和红细胞不互相凝集，其中任意一位的血清不凝集其他154人的红细胞，但他们的红细胞被所有这151人的血清所凝集（Decastello and Sturli，1872-1960）。Decastello和Sturli当时把这4人称为没有特别的型（no particular type）。后人将AB血型的发现归功于他们，因为这4位应该是AB血型。他们还发现凝集素不会被疾病所改变，验证了6个月内的新生儿的没有血型反应，这样完成了ABO血型的发现。

美国医生Reuben Ottenberg (1882-1959) 从五个家庭的样本注意到同一家的血型相似性更高 (Epstein and Ottenberg，1908)。在德国海德堡实验癌症研究所工作的医生Emil von Dungern（1867-1961）和波兰科学家Ludwig Hirszfeld（1884-1954）分析了72家的348人 (一般为两代)，证明血型符合孟德尔遗传规律(von Dungern and Hirszfeld，1910)。von Dungern 和Hirszfeld指出，对血型来说，虽然血清所含抗体很重要，细胞的抗原也很重要。他们提出A和B独立遗传，它们为两个独立遗传的基因、分别有两个等位基因（A和a，B和b），A和B共显性而它们都对O型显性。德国犹太数学家Felix Bernstein（1878-1956）指出ABO血型由一个基因决定，A、B和O是同一个基因的三种等位基因，孩子从父母遗传有六种可能性基因型（A/A，A/O，B/B，B/O，A/B和O/O）和四种表型（A，B，AB，O）（Bernstein，1924）。

ABO血型的确定，应用意义很大，可能远大于其在免疫学的基础意义。可以通过事先体外试验匹配血型，大大地提高输血的安全。按红细胞表达抗原的情况，ABO血型有四类：表达A抗原的红细胞，表达B抗原的红细胞，表达A抗原和B抗原的红细胞，既不表达A、也不表达B的O型红细胞。O型的红细胞不会被其他血型的血清所破坏，AB型的红细胞会被其他三种血型的血清所含的抗A、抗B抗体所识别引起破坏，A型的红细胞会被B型或O型血清所含抗A抗体十倍引起破坏、但不会被AB或A型血所破坏，B型红细胞会被A型或O型血清所含抗B抗体而引起破坏、但不会被AB或B型血所破坏。

早期还需要克服医生不用配血型，而直接用需要血液的患者作为检测指标的办法：先给需要血液的患者慢速少量输血，问问其反应，如果可以就多输，不行就停止。这种生物鉴定有一定的作用，但不可靠。

在多方推动下，体外配血型成为标准步骤。在有了临床简便可靠的检测血型方法（Ottenberg，1911）、有了用柠檬酸抗凝血的办法（Lewinsohn，1915）而可以在体外长期保持血液之后，血库才成为可能，大规模输血得以推行。

免疫的“我”v“它”：免疫耐受

区分自我与非我，这一重要哲学问题的答案只能来自神经生物学。

区分自我与非我也是免疫学的重要问题之一。免疫系统如果不能区分我与它，就会出现紊乱：免疫系统对自己进行攻击，是自身免疫疾病。免疫系统如果不能有效地发现有害的异己，是免疫缺陷，容易感染疾病。这些异己既包括外界入侵的病原微生物，也包括体内的变化，如癌细胞。

对免疫系统来说，什么是自我? 什么是异己?如何解决这一问题?

1916年，芝加哥大学的Frank Lillie（1870-1941）发现双生子在胚胎期有血液连通。如果双生子一雄、一雌，雌性出生长大后会出现不育现象，因为胎儿期间血液连通导致雄性的雄激素由血液进入雌性胎儿，后者受雄激素影响，以后不能生育，这种母牛称为freemartin，造成农民的损失，如果早期发现，可以不养大这种以后不能生育的牛。

Lillie对这一现象的解释，引起农民的孩子Ray Owen（1915-2014）读研究生之后进行了实验：如果双生的牛在胚胎时期血液连通，那么对免疫是否有影响。1945年，在美国威斯康辛大学的Owen发表了80对牛双生子的血液抗原性的研究结果。他检测了80对双生牛的四十多种血液抗原，发现大部分双生牛的血液抗原完全一样（Owen，1945）。他推测不可能是因为它们都是基因几乎完全相同的同卵双生，因为：1）已知牛双生子同卵双生低于异卵双生的几率；2）双生牛长大后，其中一只不能完全将自己的抗原传给后代，反过来说明它本身的抗原性并非都是遗传因素造成；3）在罕见的来自不同父亲、同一母亲的两只双生牛的情况下，它们还是抗原完全相同，这不可能是遗传所致；4）Owen发现部分双生牛出生后含两种不同的红细胞。对这些结果的最简单解释是因为胚胎期间血液连通，双生牛有细胞交换，而不仅Lillie提出的分子交换。交换的细胞可能有红细胞的胚胎前体细胞，这样在成年动物血液发生系统中一生不断产生新的红细胞。

Owen提出其研究的一个应用：可以在早期通过检测血型抗原性知道双生牛是否有血液连通，如果有连通，其抗原就会完全一样，是freemartin而不用继续养。如果不一样则说明它们胎儿期间无连同血液，这种小母牛可以继续养。这种早期诊断freemartins的方法，可以为农民节省资源。Owen回馈了类似自己父母的众多农民。

Owen再观察到一对牛生的5胞胎，它们分别来自五个受精卵，但检测其血型14种抗原，发现完全一样，而且它们都拥有父母分别拥有的抗原（Owen et al., 1946）。Davis加州大学的研究者在羊也观察到类似的结果（Stormont, Weir and Lane，1953）。

注意Owen研究的科学家不多。澳大利亚的科学家提出：Owen的实验的重要意义在于，胚胎期间种植的外源细胞可以被宿主永远耐受（Burnet and Fenner，1949）。

澳大利亚免疫学家Frank Macfarlane Burnet（1899-1985）长期在位于墨尔本的Walter and Eliza Hall医学研究所工作。在总结Owen研究的意义时（Burnet and Fenner，1949），他们还回顾了多个相关研究结果：大鼠肉瘤种植到成年鸡引起免疫反应，而种植到鸡胚不引起免疫反应（Murphy，1913）；白喉类毒素注射到鸡胚不引起免疫反应（Grasset，1929）；在兔（Baumgartner，1937）和鸡（Wolfe and Dilks，1948）都呈现越年幼的动物其免疫反应越低；接种到12天鸡胚的流感病毒，在第14天小鸡检测不到抗体，而在成年鸡接种可以引起抗体反应（Burnet，1941）。

我们还记得：Landsteiner文章表3胎盘的红细胞血型就不容易定，他当时决定搁置不考虑胎盘结果（Landsteiner，1901）。而这也是动物年龄与免疫反应关系。

南非出生的英国生物学家Peter Medawar （1915-1987）和他的同事在研究双生牛的皮肤时发现，如果进行皮肤移植，不仅同卵双生的牛之间没有排斥反应，异卵双生的牛（即使其性别不同）之间皮肤移植也没有排斥反应，而兄弟姐妹之间皮肤移植有排斥反应（Anderson et al., 1951；Billingham et al.，1952）。Medawar等认为这与Owen的发现一致。他们认为不太可能是移植物的抗原变化而适应宿主，推测是宿主成年产生抗体的免疫系统对胚胎期见过的抗原不再反应。为此，他们进一步实验，发现“主动获得性免疫耐受”。他们较为详细地叙述实验73（Billingham，Brent，Medawar，1953）。将来自一种小鼠（A）睾丸、肾脏、脾脏等器官组织的成年细胞注射到另一种（CBA）孕鼠的胚胎，5只幼鼠出生8周后，将A皮肤移植到CBA鼠，再等11天后，2只小鼠排斥移植皮肤，而三只小鼠对A的皮肤类似其对自体皮肤的移植，完全成功地接受了移植的皮肤。50天后再移植A的皮肤，也完全没有免疫排斥。第77和101天，研究者从对A有强烈免疫性的CBA小鼠取得淋巴结，腹腔注射入胚胎期间接受过A皮肤移植的小鼠，移植的皮肤两三天内就脱落。接受过移植的CBA小鼠产生的后代对A皮肤仍然排斥。这一实验说明，移植皮肤的抗原性并未消失，也并非因胚胎期间注射的A细胞长期存活，在成年竞争抗体。免疫耐受不能遗传给后代。他们还有其他实验表明，主动获得性免疫耐受有抗原特异性，胚胎期注射A细胞的CBA鼠，对A的免疫反应降低，但对AU鼠来源的皮肤免疫反应不变。他们给96只出生后的新生小鼠注射外源抗原，难以引起免疫耐受。他们还用鸡做了实验，将11天的Rhode Island Red鸡胚的血细胞注射同龄到White Leghorn鸡胚，孵出14天后，Rhode Island Red的皮肤移植到White Leghorn的成功率也显著提高（Billingham，Brent，Medawar，1953）。他们后来用了更多种属的动物（包括兔、大鼠和双胞胎的鸡）、样本量和统计证明主动获得性免疫耐受（Billingham，Brent，Medawar，1956）。Medawar的基本结论，很快被其他研究者证明（Simonsen，1955，1956，1957；Hašek and Hraba，1955）。

1948年，Burnet提出自我标记物（self markers），认为个体对自己的细胞不发生免疫反应的原因是每个细胞上都有少数几个自我标记物（Burnet and Fenner，1948），但不清楚自我标记物与胚胎免疫耐受的关系（Burnet and Fenner，1949）。他对自我标记的想法持续到1956年（Burnet，1956）。免疫耐受可以有两种方法发生：要么身体的抗原都被抗体产生机制所识别为自我，要么所有外来抗原都被识别是异物（Burnet，1959）。Medawar的主动获得性免疫耐受实验说明免疫系统不需要识别自我，而只需要在胚胎时期清除识别自我的免疫机制，出生后新遇到的都是非我抗原。Burnet后来也承认自我标记物为半神秘的、缺乏吸引力（Burnet，1959）。Burnet在克隆选择学说中提出胚胎期间身体不同组分直接相互作用，导致出生后不产生对身体可接触部分的抗体（Burnet，1957，1959）。

免疫耐受还有更复杂和有趣的机理。宿主可以对移植物有免疫反应，还有移植物对宿主的免疫反应。而主要组织相容性复合物（Major histocampability complex，MHC）的作用更是妙趣横生，但不在本章范围。

抗体的产生和作用：侧链学说

免疫学家多年试图理解抗体形成的机理。

1900年，Ehrlich提出侧链学说（side-chain theory）是第一个有影响的解释抗体形成过程和作用机理的学说（Ehrlich，1900）。

Ehrlich的侧链学说，与其早期研究不能全然分开（Ehrlich，1878，1885，1897；Ehrlich and Morgenroth，1900c；Prüll et al., 2009）。1878年，他在博士论文中提出染料与细胞结合需要“细胞特定的化学特征”。1885年，他首次提出侧链（side-chains），认为细胞的原生质有起细胞主要作用的化学分子核团，也有起营养作用的化学分子侧链（Ehrlich，1885）。1897年，Ehrlich提出了侧链学说的雏形（Ehrlich，1897）：细胞的侧链结合毒素，结合之后侧链不能起正常功能从而使细胞补偿性地产生更多的侧链，进入血液成为抗体，这一雏形相当接近他1900年的学说，只是尚未明确提出侧链在细胞膜。Ehrlich虽然起初认为抗毒素结合毒素之后可以破坏毒素，后来认为抗毒素是中和毒素的作用（Ehrlich，1898，1899）。

1900年的文章中，Ehrlich全面阐述其侧链学说。他提出，细胞的原生质有起细胞特异功能的中心部分，也有起营养作用的侧链。根据不同细胞的需求，侧链有所不同。侧链与营养物质结合，营养物质的原子团与侧链相应的原子团发生特异的结合。这种结合类似于Emil Fischer（1852-1919）提出的酶和底物的锁和钥匙的关系（Fischer，1894）。Ehrlich提出毒素有两部分，结合部分（haptophore）与细胞的侧链结合，毒性部分（toxophore）起毒性作用。如果细胞无侧链，毒素不会对它起毒性作用，有天然免疫。如果细胞的侧链与毒素结合足够强，可以中和其毒性。如果给予毒素的剂量合适，侧链结合毒素后可以不断再生，产生新的侧链太多后，被分泌入血液，成为抗毒素。免疫的过程就是细胞产生和分泌侧链的过程，血清的抗毒素或抗体来源于细胞的侧链。

他还提出，不同的抗体可能来源于身体不同的细胞。单个抗体的免疫力可能不足，需要多个抗体。用整体细菌比用细菌细胞单个代谢产物更有效诱导多种抗体产生，这样免疫力更强。

侧链学说面临很多批评。首先，如何解释免疫系统事先存在对大量抗原有特异性的抗体。其次，如果抗体存在于毒素作用的靶细胞，那么如何解释免疫存在于血液而不存在于靶器官的情形。例如破伤风毒素作用于神经系统，但其抗体不存在于神经系统，而在血液。事后，可以看到毒素作用的靶细胞和抗体产生的细胞并非同一细胞，毒素作用的靶分子也无需是抗体分子，Ehrlich当时将两种细胞、两种与毒素结合的不同分子当成同一细胞、同一分子，解释确实简单，但并非体内的实际情况。其三，侧链起营养性作用的看法也备受质疑（Silverstein，2002）。

但是，Ehrlich的侧链学说考虑了抗原-抗体特异结合、抗体为体内已有分子、抗原选择性促进抗体产生等因素，是第一个有影响的抗体形成理论。在其前后，曾有几位研究者推测抗体来源于抗原，都被弃之不用且不影响以后的理论（Hertzfeld and Klinger，1918；Silverstein，2009）。

克隆选择学说

抗体形成的理论需要解释当时已知现象：对抗原的特异性，对多种抗原的反应，第二次引入抗原导致的反应大于第一次（Glenny and Südmersen，1921），对自身的抗原有免疫耐受。

抗体形成有直接模板学说、间接模板学说和选择学说。

Ehrlich的侧链学说是选择学说的第一个版本。

直接模板学说有几个版本，都认为抗原直接作为抗体的模板（Bail and Tsuda，1909；Breinl and Haurowitz，1930；Mudd，1932；Pauling，1940；Pauling and Delbrück，1940；Pauling, Campbell and Pressman，1943）。可以是围绕抗原进行抗体合成或组装（Mudd，1932），或在抗原诱导抗体改变其构型从而特异结合和识别（Pauling，1940；Pauling and Delbrück，1940；Pauling, Campbell and Pressman，1943）。

抗体形成的间接模板学说首先由Burnet等提出。1941年，他们提出适应酶学说，认为抗原进入产生抗体的细胞后，通过诱导酶的改变，让细胞生产对抗原特异的抗体（Burnet et al.，1941）。1949年，他们提出抗原进入细胞核或细胞浆，改变细胞的遗传物质，导致能够识别抗原的特异抗体产生（Burnet and Fenner，1949）。这一假说，到1955年Burnet写作时出现RNA和蛋白质互为模板、自我标记物改变模板的复杂版本（Burnet，1956）。

1955年，丹麦免疫学家Niels Jerne（1911-1994）提出抗体形成的自然选择学说：抗原进入身体后，在大量的已有抗体中与其中有互补构型的抗体相结合，抗原-抗体复合物被吞食细胞所摄取，之后抗原-抗体分开，抗原被破坏。抗原-抗体进入细胞后，引起细胞合成更多的同一抗体，改变血清中抗体的组成比，同一抗原再次进入体内时将遇到更多的这一抗体，而且有更多产生这一抗体的细胞，所以反应更大。

1957年，平壤出生的当时在美国芝加哥大学的David Talmage（1919-2014）从过敏的实质是免疫的观点出发，认为要理解过敏就要理解抗体，从而讨论抗体的产生。他指出Jerne的理论在本质上与Ehrlich的侧链学说有相似性：都是抗原选择抗体。但他们的差别在于Jerne认为抗原与游离的抗体结合，而Ehrlich提出抗原与细胞膜表面的抗体结合。Talmage认为细胞表面的抗体更合理，抗原选择表面有特定抗体的细胞，导致细胞增殖，产生更多的同一抗体（Talmage，1957）。

在以上基础上，多年思考抗体形成机理的Burnet提出了抗体形成的克隆选择学说（Burnet，1957）。Burnet长期研究病毒，但因参与调查疫苗事故而研究免疫学，并观察到胚胎与免疫耐受的关系（Burnet, 1941）和第二次免疫反应大于第一次免疫反应的现象（Burnet et al., 1941）。很难用直接模板学说解释为什么第二次免疫反应大于第一次（Glenny and Südmersen，1921；Burnet et al., 1941）。Burnet持续认真思考免疫学理论（Burnet，1948，1949），对Owen、Jerne和Talmage的文章都很敏感，再版书的时候不断根据新的进展更新自己的理论。

1957年8月的一个周末，Burnet写下了抗体形成的克隆选择学说（Burnet，1957）。他首先回顾了Talmage（1957）对于抗体形成理论的三种分类：直接模板、间接模板和Jerne（1955）的选择学说。他指出自己曾提出的区别自我和非我的“自我标记”想法现在看来是错误的，当时实在难以想象免疫系统怎么可能识别所有外来抗原。Burnet认为体内已有自然抗体的多样性可以很好解决区别自我和非我的问题，然后复述了Jerne的选择学说。Burnet指出Talmage（1957）认为Jerne的学说是Ehrlich侧链学说的扩展，并提出选择是在细胞水平进行。Burnet提到自己在Talmage文章之前有类似想法，但不仅是细胞，而且是同样细胞的克隆。抗体产生细胞的表面含抗原反应位点，这些位点与同一细胞合成的抗体一致（它们识别同样的抗原）。这些细胞可以释放抗体，也可以增殖产生更多同样的细胞。抗原进入身体后，附着到含结合其位点的细胞上，刺激细胞增殖（Gowans，1957；Simonsen，1957）。能够识别抗原的细胞得到刺激而增殖，其后代可以分泌相应的可溶性抗体，从而产生免疫反应。第二次免疫时，因为已有增殖的细胞，所以反应大于第一次。

Burnet在美国Vanderbilt大学进行系列演讲后，在其后的书中更详细地进行了阐述（Burnet，1959）。他先复习了细菌和病毒的克隆、突变和选择。再列举了免疫的基本事实：抗体是血清中的球蛋白，第一次和第二次免疫反应的差别，对自身的免疫耐受，淋巴组织的细胞参与免疫反应等。他已明确指出产生抗体的细胞是淋巴细胞及其相关的浆细胞（Fagraeus，1947；Coons, Leduc and Connolly，1955）。他也分析了产生自身耐受的可能机理。在抗体形成理论方面，他回顾了Ehrlich的侧链理论、Haurowitz-Pauling的直接模板理论、Burnet-Fenner的间接模板理论、Jerne的自然选择理论和克隆选择理论。

Burnet也明确提出：胚胎发育早期，有多种细胞，分别可以产生不同的抗体。与自身已有抗原接触后，有反应的细胞被清除，因而有自身免疫耐受。出生后，释放抗体，或产生抗体。

Talmage和Burnet都意识到，他们的假说带来两个要求：每种细胞只产生一种抗体（Talmage，1957；Burnet，1957）；Jerne、Talmage和Burnet的假说都需要个体能够产生数量很多的不同抗体。第一个要求很快被证明。第二个问题需要较长时间。

Gustav Nossal（1931-）医学院毕业后到Burnet实验室读研究生。他和来访的美国生物学家Joshua Lederberg（1925-2008）合作，用针对细菌鞭毛的抗体证明单个脾脏来源的细胞只能产生一种抗体（Nossal and Lederberg，1958；Nossal，1958），这一实验最后可以做到3628个细胞，只有两个细胞可能产生了两种抗体（或一种可以识别两个抗原的二价抗体），而其他3626个细胞都只能产生一种抗体（Nossal and Mäkelä，1960）。

1965年，确定了产生抗体的淋巴细胞（B淋巴细胞）的来源（Cooper, Peterson and Good，1965）。造血干细胞产生前B细胞，成为B细胞，受抗原刺激后成为浆细胞，浆细胞分泌抗体。

抗体蛋白质的基本结构 

抗体是蛋白质为多年研究的结论（e.g.，Felton，1928；Heidelberger and Kendall，1929，1935，1936；McFarlane，1935；Chow and Wu，1936；Tiselius，1937；Tiselius and Kabat，1938；Pauling，1940；Scheer, Lagsdin and Wyckoff，1941；Scheer et al., 1941）。按蛋白质电泳特征称为γ球蛋白（中文曾称为丙种球蛋白）（Tiselius，1937；Tiselius and Kabat，1938），按功能称为免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）。

主要在英国国家医学研究所的Rodney Porter（1917-1985）、主要工作在美国佛罗里达大学和印第安纳大学的Frank Putnam（1917-2006）和洛克菲勒大学的Gerald Edelman（1929-2014）等实验室揭示了Ig的基本结构（Porter，1959；Edelman and Poulik,1961; Edelman and Gally, 1962，1967；Putnam et al., 1963；Edelman et al., 1969）。Ig可以被木瓜蛋白酶(和胰蛋白酶)切为Fab段和Fc段（Porter，1950；Fried and Putnam，1960；Nisonoff et al.，1959），又可以通过二硫键还原分开（Edelman，1959； Nisonoff et al., 1960；Franěk，1961），由重链和轻链组成（Edelman and Poulik，1961）。1963年了解的抗体基本结构如图（Fleischman, Porter and Press，1963）：

到1967年确定一条轻链全部序列（Wikler et al., 1967）、1969年确定同一个Ig的轻链和重链全部序列后获得更准确的结构（Edelman et al., 1969）。一般哺乳动物Ig的概貌：两条轻链和两条重链，轻链两百多氨基酸残基、重链五百多氨基酸残基。两条重链之间以二硫键共价连接，轻链也以二硫键分别与一条重链结合。重链和轻链的氨基端为可变区域（V区），九十多个氨基酸组成，V区差异最大的部分被推断为抗体结合区域（Wu and Kabat，1970）。重链的羧基部分为恒定区域（C区）可以与补体结合，引起补体反应。

1968年，美国国家健康研究院（NIH）的科学家解析了Ig的晶体结构（Terry, Matthew and Davis, 1968）。此后进一步工作得到更精确的结果（Silverton, Navia and Davis，1978）。

按照其Fc段的差别，Ig通常分为五类：IgA，IgD，IgE，IgG，IgM。在抗原第一次刺激B细胞时，B细胞表面主要是IgM、IgD，之后出现类型转变（class switching）（Wang et al., 1970），产生和分泌IgG（和IgE、IgA）。

IgD、IgE和IgG的结构为典型的两条轻链和两条重链。而IgA是二聚体，由两个这样的亚单位组成。IgM是五聚体，由五个同样的亚基组成。导致红细胞（和细菌）凝集反应的原因是一般Ig至少有两个结合位点，可以同时结合抗原性相同的两个细胞。而多聚体的抗体更可以结合更多具有相同抗原的细胞。

对Ig的蛋白质研究得益于发现“Bences-Jones蛋白质”。1884年，英国医生Henry Bence Jones（1813-1873）从当时所谓“软骨病”人的尿液分析发现后来称为Bence Jones蛋白质的物质（Bence Jones，1848）。这种病人实际是多发性骨髓瘤（multiple myeloma）。从孤儿成长为科学家的Putnam多年研究骨髓瘤分泌的蛋白质，发现它们是Ig（Putnam and Udin，1953；Putnam，1962）。Edelman确定它们是Ig的轻链（Edelman and Poulik，1962；Edelman and Gally，1962），每一骨髓瘤分泌单一的（“单克隆”）Ig轻链（Potter et al.，1964）。可以用化学诱变剂导致正常鼠发生骨髓瘤（Potter and Boyce，1962），得到不同的骨髓瘤用于研究。发现骨髓瘤的抗体特征为发明单克隆抗体的制备技术奠定了基础，当时很快因为可以帮助获得大量同一蛋白质而有助于研究Ig的氨基酸序列。轻链的氨基酸序列得到确定（Hilschman and Craig，1965；Titani et al., 1965；Bennett et al.，1965；Putnam, Titani and Whitley，1966；Titani, Shinoda and Putnam，1969）。同一Ig的全部氨基酸序列也得到确定（Edelman et al., 1969），从而明确同一Ig重链和轻链的V区相似，更清晰重链和轻链有多少个二硫键相连。

抗体多样性产生的多种可能模型

一个人的一生中可以产生很多种抗体，有一种估计是10¹¹种抗体。

动物可以产生特异的抗体不仅对毒素、对病原菌，而且对化学分子，包括自然界不存在的化学分子。Landsteiner发现有很多化学差别能够引起不同的抗体，让人们大开眼界认识到多样性不是仅仅针对病原菌，而是识别化学特异性（Landsteiner，1936）。

每个动物的个体如何产生数量众多的不同抗体?

争论的核心问题在于：“多基因”对“少基因”， “种系发生细胞”对“体细胞”。一种观点认为抗体的基因全是进化过程中积累产生了，在种系发生细胞有很多编码抗体蛋白质的基因，甚至一一对应各种不同的抗体。另一观点认为种系发生细胞只有很少与抗体蛋白质相应的基因，在体细胞分化过程中产生更多基因（或其重组、突变）而编码所有抗体。

曾有多个假说，例如：

1）多年认为抗体产生有如酶的适应性的Burnet曾认为无需提出基因是抗体特异性的原因（Burnet and Fenner，1948）；

2）分子生物学家Lederberg于1959年提出基因与抗体的关系：抗体蛋白质的特异性由其特定氨基酸序列所决定；产生特定抗体的细胞含相应的特定核苷酸序列；抗体形成细胞的基因多样性源自其一生增殖过程中很高的自发突变率；高突变率包括细胞增殖某些时期Ig的DNA组装随机性。每个细胞在开始成熟时，按其基因型自发产生少量抗体；未成熟的抗体形成细胞在遇到同源抗原时被抑制（可以是消除细胞）；成熟的抗体形成细胞在同源刺激下成为浆细胞；抗原刺激的成熟细胞增殖，但基因型稳定，因而细胞克隆增大，产生同源抗体；抗原消失后，这些克隆仍然存在，一旦遇到同样抗原可以很快出现抗体反应（Lederberg，1959）；

3）物理学家Leo Szilard（1898-1964）于1960年提出抗体产生的理论。从细菌基因的重量和哺乳动物一个细胞内DNA的重量，他推算一个细胞内可有一百万种基因，他认为每一种抗原可以进入细胞内，通过结合特异的酶，而酶影响特异的抑制子，抑制子抑制特异抗体蛋白质的产生，抗原的作用在于对相应抗体的产生去抑制（Szilard，1960）。这一理论需要在种系发生细胞就存在很多基因，不需要体细胞基因改变。这一理论的基础之一（细胞所含基因数量）错了，1990年代全基因组测序显示人的细胞能够编码蛋白质的基因约两万而已；

4）1962年，当时在美国Wisconsin大学的英国科学家Oliver Smithies（1925-2017）等提出结合珠蛋白（haptoglobin）的基因可以有基因重组（特别是基因复制duplication）和点突变（Smithies, Connell and Dixon，1962）。1963年，Smithies提出同一条染色体基因重组（特别是基因交叉及其导致的倒位）是Ig多样性的机理之一，另一机理为Ig基因的碱基突变（增加或减少碱基导致移码突变）（Smithies，1963；1967）；

5）1965年，加州理工学院的William Dreyer（1928-2004）和Claude Bennett提出：在种系发生细胞的同一条染色体上，一部分由多个编码V区的序列重复组成（例如成为环状DNA）。而编码C区的序列可以如细菌病毒形成过程一样在染色体之外。在体细胞分化过程中，C区域的DNA只与V区域序列之一（多个环之一）匹配而产生独特的轻链（Dreyer and Bennett，1965）；

6）意大利纳布纳斯国际遗传学和生物物理学实验室的科学家提出：编码Ig的基因其遗传密码有特殊性，同一个密码可以被翻译成为不同的氨基酸（Potter，Appella，Geisser，1965）。也许从几百个特殊区域选其中一到两个与C区组成一条Ig（Cioli and Baglion，1966）；

7）Leroy Hood（1938-）成为加州理工学院Dreyer的研究生，他们提出：N端V区的肽段与C端分别由两个基因指导编码产生，之后两个肽段由酶促反应所连接称为单个肽段，或编码N端和C端的两个基因融合、或其RNA融合（Hood, Gray and Dreyer，1966）；

8）剑桥的英国医学研究基金会（MRC）的分子生物学实验室（LMB）的分子生物学家Sydney Brenner（1927-2019）与免疫学家César Milstein（1927-2002）提出：编码共同区域的核酸序列是酶的识别位点，这种酶切割DNA，切割后DNA在修复过程中在V区引入变异（Brenner and Milstein，1966）；

9）Edelman提出：在进化过程中，编码Ig的基因发生串接重复（tandem duplication），可能重复到50个左右。它们出现点突变，从而不同。在哺乳动物个体的淋巴细胞成熟过程中，出现体细胞的DNA交叉（somatic cross-over），产生基因突变（Edelman and Gally，1967）；

10）剑桥大学植物系的遗传学家提出在同一个染色体上，有多个编码Ig的基因重复排列，淋巴细胞成熟过程中，发生同一染色体内的交叉（intrachromosomal cross-over），两个基因连在一起编码一个Ig（Whitehouse，1967），这一假说在Dreyer and Bennett（1965）基础上进了一步，编码C区的基因不再是在染色体外，而是与编码V区的基因同在一条染色体上；

11）伯克利加州大学科学家提出编码V区域的基因与编码C区域的基因需要在DNA或RNA水平连接（Koshland, Davis and Fujita，1969）;

12) 到1970年，Hood和Talmage还认为种系发生假说更有吸引力（Hood and Talmage，1970）；

13）Edelman提出：在淋巴细胞成熟过程中，编码V区的多个基因中的一个因为基因转位（translocation）而与编码C区的连接在一起，编码Ig（Gally and Edelman，1970）；

14）Jerne提出免疫器官是突变发生器官（mutant-breeding organs），其中淋巴细胞编码Ig的基因出现体细胞基因突变，生成多种抗体（Jerne，1971）；

15）Salk研究所的Melvin Cohn（1922-2018）提出：所有体细胞都有低频的基因突变，种系发生细胞有25到50个V基因，这些基因在体细胞中出现低频突变，在高变异区域的突变比其他序列高10到100倍（Cohn，1971）；

16）英国国家医学研究所的科学家提出有三套V基因，都存在于种系发生细胞（Williamson，1972）。

综上所述，仅仅依据于当时已知Ig的轻链和重链有V区和C区、V区有多种氨基酸序列，可以提出多种假说。每一种假说都有其理由，而且提出者常指出其他假说为什么不对，但不能停留在猜测。

分子生物学实验确定抗体产生的机理

只有实验能确定抗体产生的确切机理。

种系发生细胞学说认为对应于每一个抗体（包括其V区）都有一个特定的基因，就有较多基因；而体细胞变异学说认为变异导致更多基因，早期不需要很多基因。所以，区分这两类假说最简单的方法是检测编码V区基因的数量。

第一个用实验推测抗体基因数量的是美国西雅图华盛顿大学的Ursula Storb。她取脾脏的DNA，放射性标记脾脏和骨髓瘤的RNA，看它们之间的杂交量，而加没有标记的肝脏RNA作为没有抗体RNA的来源。她假定肝脏RNA竞争掉了非Ig的基因结合，剩下的主要是Ig的基因与脾脏和骨髓瘤的RNA结合。以此，她得到结果推测每半个基因组有6千到1万4千个序列可以编码Ig的V区。因这一数量足够大，她认为支持抗体变异的种系发生细胞学说（Storb，1972）。

这种方法有很多影响因素，推测不够准确。更可靠的方法需要提取Ig重链或轻链的mRNA，在体外翻译系统证明其编码Ig，高度特异标记这种mRNA或其cDNA，检测它与基因组DNA的杂交速率，从而推测DNA的拷贝数（Delovitch and Baglioni，1973）。在不能DNA测序的情况下，当时能用于分析DNA重复序列拷贝数的是C0t分析（Waring and Britten，1966；Britten and Kohne，1968）。以此方法，麻省理工学院（MIT）的科学家提取骨髓瘤MPC11中编码Ig轻链的mRNA，它与肝脏或骨髓瘤的DNA杂交，推测重复数为40到500，不足以支持种系发生细胞学说 (Delovitch and Baglioni，1972，1973)。

纽约市立大学的研究者分析多种哺乳类动物的重链V区序列，发现它们的变化有进化规律，而且有限，认为支持少基因的体细胞变异学说（Capra, Wasserman and Kehoe，1973）。

1974年，多个实验室进行了C0t分析。Storb的结果推测有2500到5000个κ轻链的V区（Vκ）基因，继续支持种系发生细胞学说（Storb，1974）。洛杉矶加州大学（UCLA）的Williamson推测重链的V区（VH）基因有5000个，也支持种系发生细胞学说（Premkumar，Shoyab and Williamson，1974）。但是，在瑞士Basel免疫研究所工作的日本科学家利根川进（1939-）等的结果都支持少基因学说。利根川进通过MPOC70E骨髓瘤获得的结果推算小鼠每半基因组最低可能只有一个Vκ基因、最高200个（Tonegawa et al., 1974a）。剑桥大学的科学家用MPOC21骨髓瘤的结果推算有1到250个Vκ基因（Rabbits et al.，1974）。利根川进分析MPC11骨髓瘤的Ig重链基因推算小鼠每半基因组可能只有一个VH基因（Bernadini and Tonegawa, 1974）。瑞士科学家分析MPOC41骨髓瘤的结果支持只有两个拷贝的CH基因（Faust, Diggelman and Mach，1974）。用高度纯化的MPOC41来源的Cκ的mRNA，当时在NIH的Philip Leder （1934-）实验室工作的本庶佑（Tasuku Honjo，1942-）等推测它只有2到3个拷贝，不支持种系发生细胞学说（Honjo et al.，1974）。旧金山加州大学的研究者也推测Cκ只有3到4个拷贝（Stavnezer et al.，1974）。利根川进在更严谨的实验条件下得到的数据进一步支持Vκ基因数量可能为1、不超过200（Tonegawa et al., 1974b）。

Milstein实验室从MPOC21骨髓瘤纯化了编码其κ轻链的mRNA，并进行了DNA短片段的序列测定（Brownlee et al.，1973）。进一步分析多个小片段的序列后，他们确定编码V区和编码C区的核酸序列肯定在同一条mRNA上，从而明确是同一个基因编码V区和C区两段氨基酸序列（Milstein et al.，1974）。

Leder进一步研究发现，MPOC41的Ig基因编码C区的拷贝数只有2.7，但编码V区的拷贝数在30至50之间（Leder et al.，1974），他们提出在DNA或者RNA水平，需要有迄今未知的机理，将编码V区的部分与编码C区的部分连起来。

英国科学家还用MOPC21骨髓瘤进行分析推测V区和C区都只有几个拷贝（Rabbits and Milstein，1975）。利根川进纯化λ和κ轻链的mRNA达到90%以上的纯度，发现λ和κ轻链的DNA一样拷贝数有限，再加上当时已知的氨基酸序列，他推算约25种Vκ（或Vλ），不支持种系发生细胞学说（Tonegawa et al.，1976）。瑞士日内瓦大学科学家分析MPOC41骨髓瘤编码轻链的基因完全没有重复，重复由污染的DNA造成（Farace et al.，1976）。本庶佑等推测Vλ只有两个拷贝（Honjo et al.，1976）。

1976年，小泉纯一郎（Nobumichi Hozumi，1943-）和利根川进设计简单而巧妙的实验检测胚胎期的Ig基因与成体Ig基因的差别（Hozumi and Tonegawa，1976）。他们用Balb/c衍生的MOPC321骨髓瘤纯化其编码Igκ轻链的mRNA，比较12、13天Balb/c鼠胚和MOPC321与之杂交的DNA（编码κ轻链的DNA）。他们用限制性内切酶BamH1将基因组DNA切成小段，然后看哪些片段可以杂交κ轻链mRNA所制备的放射性标记的探针。他们将κ轻链的RNA探针分成全基因的探针和3’端的探针，因为C区在3’端，所以这两个探针的差别部分应该是V区的信号。在胚胎中，κRNA探针可以杂交到两个分子量分别为6.0和3.9百万道尔顿的BamH1片段，其中6百万道尔顿的片段只与全长的κRNA探针杂交，不与3’的κRNA探针杂交，3.9百万道尔顿的片段与全长和3’的两种κRNA探针都杂交，所以6百万道尔顿的基因组BamH1片段应该含V区和C区，而3.9百万道尔顿的片段只含C区、不含V区。在MOPC321骨髓瘤中，利根川进实验室发现只有一个2.4百万道尔顿的BamH1片段与全长和3’的两种κRNA探针分别都杂交。他们的结果提示在胚胎中两个不相连接的片段，而成熟的免疫细胞中成了一个片段，因此染色体发生了重组。他们认为不会是因为基因序列变化正好失去了BamH1的酶切位点，因为如果失去一个位点，长度应该是9.9而不是2.4百万道尔顿。需要同时改变几个BamH1切割位点的序列才能得到2.4百万道尔顿的片段。以后他们换了限制性内切酶也观察到类似的变化，而且用λ轻链也观察到类似变化（Tonegawa et al.，1977a）。Tonegawa讨论了几种V和C区基因重组的模型（Hozumi and Tonegawa，1976；Tonegawa et al.，1977a）。英国科学家用类似方法观察到胚胎与骨髓瘤来源Ig基因的V区和C区有染色体重组，但以为V和C区即使在骨髓瘤仍并非紧邻（Rabbits and Forster，1978）。

1973年，旧金山加州大学生物化学系的Herbert Boyer（1936-）和斯坦福大学微生物系的Stanley Cohen（1935-）发明重组DNA技术（Cohen et al.，1973）。DNA序列测定方法至1977年成功地建立（Wu，1972；Maxam and Gilbert，1977；Sanger, Nicklen and Coulson，1977）。

技术的进步推动了基因的分析。1977年，来源于12天鼠胚的Igλ轻链基因成为最早克隆的几个基因之一（Tonegawa et al.，1977b），它含编码V和C的部分。利根川进实验室还克隆了HOPC2020骨髓瘤的λ轻链基因，也含编码V和C的部分，用电子显微镜检测杂交推算其Vλ和Cλ间隔1250碱基对（Brack and Tonegawa，1977）。Leder实验室克隆了MOPC149骨髓瘤的两种Vκ基因的DNA，发现可能有多种序列有差别的Vκ基因（Seidman et al.，1978）。利根川进实验室克隆了全长的胚胎来源的λ轻链基因和HOPC2020来源的λ轻链基因，通过电镜等分析确定V和C在淋巴细胞分化过程中应该有重组。重组应该发生在V和C之间的J序列，实际为V-J重组（Brack et al.，1978）。Leder实验室分析了22种κ链的J序列，胚胎不仅有多个Vκ序列也有多个Jκ序列，在淋巴细胞成熟过程中，其中一个Vκ、一个Jκ经过V-J的连接被选择，但他们当时不确定其机理是DNA重组还是RNA剪接（Weigert et al.， 1978）。利根川进实验室再克隆和分析鼠胚全部Jκ序列，其中有5个不同的Jκ序列，而成熟后浆细胞只有一个Jκ序列，他们分析认为在染色体V-J重组过程中，其间的序列失去而被选择的Vκ与Jκ连接（Sakano et al.，1979）。Leder实验室也有类似结论（Seidman, Max and Leder P，1979）。

1980年，加州理工学院的Hood实验室、回日本东京大学的本庶佑实验室、Basel免疫研究所的利根川进实验室确定淋巴细胞成熟过程中Ig基因发生了两次重组，一次是编码V区的部分与编码J序列的部分（V-J），一次是编码J序列的与编码C区的部分（J-C，亦称class switching）（Davis et al.，1980；Kataoka et al.，1980；Sakano et al.，1980）。利根川进实验室进一步发现在重链的J序列前面还有一段D（diversity）序列，一共有8种，所以还有V-D重组（Kurosawa and Tonegawa，1982）。

1983年，利根川进总结体细胞染色体重组如图。

染色体重组的多样性是Ig序列多样性的一个重要来源。人的抗体由两条重链和两条轻链组成。人的14号染色体编码Ig重链基因，由2号染色体编码κ轻链，22号染色体编码λ轻链。功能性重链基因片段包含46种V区段、23种D区段、6种J区段。功能性κ轻链有33种可能的V、5种J，无D区段。功能性λ轻链基因有33种V、5种J，无D区段。每一个抗体来自这些的组合，至少有5x10¹³种可能。这不仅是B淋巴细胞产生抗体多样性的机理，也是T淋巴细胞表面受体的多样性机理，人的T细胞受体因此可以有约10¹⁸种可能的组合。

重组激活基因的发现

Ig基因重组的分子机理在于重组酶。

1984年，分子生物学家David Baltimore（1938-）当时在MIT实验室的研究生Susanna Lewis设计了实验，用κ轻链基因的部分序列重构V-J重组。他们选取了鼠胚Vκ和Jκ及其附近的DNA序列，装在病毒里面。将这种病毒感染淋巴细胞样的体外培养细胞系PD。他们在序列Vκ和Jκ之间，装了来自细菌的可以产生对霉酚酸起抵抗性的黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（xanthine-guanine phosphoribosyl transferase，gpt）。因为预计重组导致其间DNA序列翻转，所以放到病毒的是反向的gpt序列。一旦发生Vκ和Jκ之间重组，其间的序列翻转，gpt成为正向而可以表达GPT蛋白质，细胞能够抵抗霉酚酸。Lewis等成功地观察到，她们的分子构造，转染入PD细胞系后，经过霉酚酸后得到的细胞株多数都是因出现了Vκ和Jκ之间DNA重组、gpt序列翻转（Lewis et al.，1984）。

Baltimore实验室的另一位研究生David Schatz用类似Lewis的方法，再构建了一个含B潮霉素抗性基因（hph）的病毒。用两种病毒，他们检验了多种B细胞前体细胞样的细胞系，多数能够重组Vκ和Jκ之间DNA、翻转gpt或hph抗性基因序列，导致细胞对霉酚酸或B潮霉素有抵抗性。但如果用同样的病毒感染3T3成纤维细胞系，就不能发生Vκ和Jκ之间DNA重组（Schatz and Baltimore，1988）。Schatz在实验室周会上讲自己工作进展时，以色列来的博士后Yoav Citri（1953-1995）建议想办法激活3T3细胞中的V（D）J重组活性，这一建议影响了后面的研究（Schatz and Baltimore，2004）。

要在3T3细胞发生Vκ和Jκ之间DNA重组，当时一般的设计应该是把可重组Vκ-Jκ的细胞（前B细胞）的mRNA做成cDNA文库。文库的大量不同cDNA转染到3T3细胞，后者含有可以检测Vκ和Jκ之间DNA重组的gpt或hph。在没有转染来自前B细胞cDNA的情况下，3T3细胞会被霉酚酸或B潮霉素杀死。而如果有前B细胞的cDNA导致Vκ和Jκ之间DNA重组，使得其间的gpt或hph基因成为可以表达的方向，从而有GPT或HPH合成，这样的3T3细胞就能抵抗霉酚酸或B潮霉素。多数3T3细胞都被转染了来自表达不能起重组酶作用的cDNA，这些3T3细胞会被霉酚酸或B潮霉素杀死，剩下可抵抗霉酚酸或B潮霉素的3T3细胞就很可能是表达了可以导致Vκ和Jκ之间DNA重组的重组酶的cDNA。

因为一种细胞表达很多mRNA从而可以得到很多不同的cDNA，如果是一种cDNA编码重组酶，那么这种方法一般是可行的。但是，如果是多种cDNA编码的蛋白质才能引起Vκ和Jκ之间DNA重组，那么同时含有两种或多种起作用的cDNA的几率就会很小。Baltimore当时在Whitehead研究所的同事Robert Weinberg（1942-）用分子生物学研究癌症，Weinberg实验室用基因组DNA制备文库。将这种文库转染到3T3细胞时，每个3T3被转染的不会只是单个cDNA，而是一段基因组DNA，如果基因组DNA含相邻几个基因的时候，就可能是几个基因。

Schatz把B淋巴瘤的基因组DNA转染到3T3，基因组DNA接了一种抗性基因（组氨醇脱氢酶），首先用这种抗性基因针对的药物（组氨醇）选择被B淋巴瘤的基因组DNA转染了的3T3细胞。然后用霉酚酸选择发生了V-J重组的3T3细胞。他们从1500个抵抗组氨醇的3T3细胞克隆得到1个抗霉酚酸的3T3细胞株（Schatz and Baltimore，1988）。他们分析发现这一3T3细胞株确实出现了Vκ和Jκ之间DNA重组，使得其间的gpt表达，而不是其他原因对霉酚酸出现抵抗。但很多人不信，他们附近的实验室认为他们的结果不可靠、发表的是伪迹（Schatz and Baltimore，2004）。

Schatz与研究生Marjorie Oettinger组成两人合作，每天倒班、想方设法克隆重组激活基因（RAG）。他们用特定的寡核苷酸标记基因组的DNA，从出现重组的细胞中通过用于标记的寡核苷酸取得基因组DNA片段，以此克隆了RAG的催化亚基RAG-1（Schatz, Oettinger and Baltimore，1989）。RAG-1基因编码含一千余氨基酸残基的蛋白质，其同源基因存在于有V（D）J重组的动物如人、鼠、兔、羊、马、鸡、蛙。在人和鼠能够进行V（D）J重组的细胞系，RAG-1也有表达。RAG-1表达于鼠的胸腺、骨髓和胚胎，而不在脾脏和脑表达。所以RAG-1表达的细胞和组织也与V（D）J重组活性相关。

在一派大好的形势下，有个异数：含RAG-1基因的18kb DNA，催化V（D）J重组的活性居然与最初全基因组切的片段效率一样，比预计的低100到1000倍。当时他们的估计是也许因为所用的基因组DNA不够长，缺乏某些未知的转录控制元件和34个氨基酸（Schatz, Oettinger and Baltimore，1989）。但她们发现，得到全长的cDNA后，活性也不高（Oettinger et al.，1990）。他们经过几个月的迷惑不解，不断提各种可能。其中一个比较难以置信的可能性是RAG-1旁边碰巧还有一个基因，与它共同起作用（Schatz and Baltimore，2004）。在细菌中，已知相关功能的基因聚集在附近，而动物细胞的基因早已知道并非如此。

她们发现在原初有重组活性的18kb基因组DNA中，RAG-1基因只占其中6.6kb，另有11kb，余下的基因组DNA中还有一个基因。她们进一步的工作证明这个基因可以提高RAG-1重组效率1000倍，因此她们称这一基因为RAG-2（Oettinger et al.，1990）。以后知道，RAG-1独立进化自转座酶Transib，后来又捕获了RAG-2基因进一步增强其活性，之后RAG-1和RAG-2的序列和功能变化成为专门用于Ig基因重组的酶（Carmona and Schatz，2017）。

结语

哺乳动物体液免疫的主力为B淋巴细胞，它们在胚胎期间受到“驯化”，是区别自我和非我是产生免疫耐受的一种方式：凡是胚胎期接触频繁的已有抗原被认为是自身抗原，识别自身抗原的新成熟B细胞在骨髓中被抑制或被诱导死亡，剩下的细胞识别外来（或体内以后异常而产生）的抗原。还有其他产生免疫耐受的方式。

抗体是蛋白质，哺乳动物中除骆驼科动物抗体缺少轻链外，抗体一般由两条轻链和两条重链组成。它们有结合抗原的变异V区，和恒定的C区。在幼稚B细胞，编码V区的有多个序列，还有多个J序列，和有限的C区。在重链还有位于J序列的N端的多个D序列。由染色体V（D）J重组导致特定的一种V序列与特定的一种D和/或J序列连接，重组的产物作为一个外显子与C区一起表达成熟的Ig基因。因为重组过程中选择和组合的多种可能而提供抗体的多样性。此外，V（D）J重组过程中连接位点处序列的多样性还可以得到增加：DNA断裂位点连接之前的加工、处理，如碱基的随机筛除（deletion），P序列增加（P Nucleotide Addition），由末端转移酶（terminal dideoxy transferase, TdT）介导的N序列增加（non-template nucleotides addition）（Alt and Baltimore，1982；Desiderio et al.，1984）。

最初在B细胞表达的是膜结合的抗体Ig与2个跨膜蛋白Igα、Igβ组成的B细胞受体（BCR）（Raff, Steinberg and Taylor，1970）。BCR受抗原刺激后，通过Igα和Igβ将信号转导给细胞内，刺激B细胞增殖和分化成熟，包括基因突变和选择，抗体亲和力提高，成为浆细胞或记忆细胞。一旦再次得到抗原刺激，快速分泌抗体Ig。

除体细胞重组之外，Ig序列多样性还有一个来源：体细胞高频突变（somatic hypermutation）。在V（D）J外显子区，特别是其与抗原结合的区域，特异酶催化单个碱基突变。体细胞基因突变，最早由Lederberg提出（Lederberg，1959），Brenner和Milstein进一步提出抗原结合区域的突变频率可能高于其他序列（Brenner and Milstein，1966）。蛋白质序列分析（Weigert et al., 1970）和基因测序发现确实有体细胞突变（Bernard，Hozumi and Tonegawa，1978；Brack et al.,1978），而且淋巴细胞接触抗原时间越长、其Ig基因变异越多（Griffiths et al.，1984；Berek and Milstein，1987）。体细胞高突变的机理是活化诱导的脱胺酶（activation-indued deaminase，AID），它催化脱氧胞嘧啶脱胺，碱基变化及其修复导致Ig序列多种变化（Di Noia and Neuberger，2007；Teng and Papavasiliou，2007；Peled et al., 2008）。

免疫与疾病有双重的密切关系。免疫过低导致罹患感染、增加癌症的可能，免疫过强导致过敏反应和自身免疫性疾病。

免疫学研究不仅加深了人类对于免疫学原理的理解，也带来了超出免疫学应用的技术。放射免疫检测（Radioimmunoassay，RIA）（Yalow and Berson，1960）和酶联免疫吸附检测（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）（Engvall and Perlmann，1971）用于定量检测微量分子。流式细胞检测（flow cytometry）、也称荧光激活细胞分离器（fluorescence-activated cell sorter，FACS）可以根据表面抗原和其他差异化的分子标记而分离多种细胞。克隆选择学说的直接应用诞生了单克隆抗体技术，它不仅可以用于检测、而且可以用于治疗（Köhler and Milstein，1975）。免疫学原理和技术也有助于理解和治疗非免疫系统的疾病（如癌症的诊断和治疗）。

注1：1901年的诺贝尔生理或医学奖为什么只给了von Behring而不包括北里，讨论的文章如：Kantha（1991）。本章涉及的免疫学工作获诺奖的：Emil von Behring（1901）、Élie Metchnikoff（1903）、Paul Ehrlich（1909）、Jules Bordet（1919）、Karl Landsteiner（1930）、Frank Macfarlane Burnet（1960）、Peter Medawar（1960）、Rosalyn Yalow (1977)，Niels Jerne（1984）、Rodney Porter（1972）、Gerald Edelman（1972）、Susumu Tonegawa（1987）。微生物学家科霍（Robert Koch）因其研究病原菌而获奖（1905），分子生物学家Joshua Lederberg因研究细菌的遗传学而获奖（1958），分子生物学家David Baltimore因发现逆转录酶获奖（1975），César Milstein因发明单克隆抗体技术获奖（1984）， Oliver Smithies以后因发明基因敲除技术获奖（2007），本庶佑以后因对肿瘤免疫的贡献获奖（2018）。

注2：英国Richard Lower的输血实验，1666年由他的同学Robert Boyle (1627-1691)提交皇家学会，并有Boyle的提问和建议 (Boyle，1666)。他们都是“牛津实验哲学俱乐部”的成员。

注3：在博士论文中，Ehrlich发现肥大细胞（Ehrlich，1878）。在Charité医院期间，他通过染色发现了中性粒细胞、嗜酸性白细胞、嗜碱性白细胞（Ehrlich，1891a）。他还研究了贫血和白血病，并参与主编《贫血》一书。因为Ehrlich在血液学的科学发现和技术发明，科学史家称其为“血液学之父”（Wintrobe，1985）。

注4：Pfeiffer现象有两方面意义，其二是发现内毒素的起点。他发现加热之后的霍乱弧菌还有毒性，所以提出细菌的细胞被破坏后，释放了对热不敏感的毒素。

注5：Landsteiner当时有沉重的病理解剖任务，1897年至1907年他做过3639次。在这样的情况下，他发表了75篇论文（52篇血液学、12篇细菌学、11篇病理解剖学）。他有多项科学发现，除了血型之外，他于1909年与Erwin Popper医生（1879-1955）发表他们对脊髓灰质炎的研究，他们在1908年11月到12月的实验成功地将脊髓灰质炎从患者儿童引入猴，对发现脊髓灰质炎病毒起了很大作用。脊髓灰质炎不能感染小鼠、豚鼠、或兔子，但可以感染猴，并且发病类似人。Landsteiner的血型研究，始于1900年文章的注脚，其后他经常引用文章的页码是注脚出现的361页，而不是全文的页码。他移民美国后在洛克菲勒医学研究所工作，还发现了Rh血型（Landsteiner and Wiener，1940）。

注6：在Belfanti and Carbone（1898）的基础上，Bordet（1899）和Ehrlich and Morgenroth（1900b）提出了补体（complement）的功能及其机理。Bordet称补体为alexin, Ehrlich曾称补体为addiment。抗体一个位点与红细胞结合，另一位点与补体结合。在本章所涉及的实验中，凝集反应无需补体，溶血反应需要补体。

注7：当时所谓凝集红细胞的凝集素，后来知道一般是IgM，人和鼠的IgM有五个亚基，可结合多个红细胞，从而造成凝集。

注8：英国医生、微生物学家Charles Todd（1869-1957）因为埃及出现每天死上千头牛的牛瘟而于1904年到开罗工作。1910年6月，他在皇家学会宣读论文（Todd and White，1910a），此后发表全文（Todd and White，1910b）。他们的研究基于Ehrlich and Morgenroth（1900a）用豚鼠做的实验。Todd和White用106头牛的血清和红细胞在体外做研究。他们发现：与豚鼠一样，每头牛的血清不会对自己的红细胞发生溶血反应，而会溶解一些其他牛的红细胞。但如果事先将一头牛的血清用另外一头牛（A）的红细胞进行共育一小时，然后再检测这种血清，它不再溶A牛（和一些牛）的红细胞，但继续溶解其他一些牛的红细胞。他们称之为“耗竭”（exhaustion）。他们当时着重于牛的个体识别，而实际也给免疫耐受的理解埋下了伏笔。虽然免疫耐受是在细胞水平--而不是抗体分子水平--的去除。

注9：Burnet于1929年发现第二次免疫反应大于第一次，但这一结果被英国医学杂志拒稿，他后来讲其发表于1941年无需同行评审的研究所发行的单行本中的结果（Burnet et al.，1941）。他发表于1956年的书显然是1955年写作时还没有Jerne的文章。Burnet对澳大利亚的科学有很大影响，1957年他决定将Walter and Eliza Hall研究所全部集中研究免疫学，使之长期成为国际免疫学研究重镇。

注10：Gustav Nossal的曾祖父母是犹太人，因此其家庭也在希特勒时代被迫离开维也纳移民澳大利亚。他从医学院毕业后，对病毒研究很感兴趣，1957年被推荐到Burnet实验室读研究生。结果发现Burnet“转行”全部研究免疫，不再研究病毒，非常惊讶，非常不情愿。为了做实验，他读了文献，特别注意到即将从美国来其所在澳大利亚研究所访问的Joshua Lederberg的方法可以用于自己的研究。

注11：Joshua Lederberg因研究细菌间的遗传物质转移而获1958年诺贝尔奖。他当年已到澳大利亚与Burnet实验室合作，后从Wisconsin搬到Stanford创办遗传学系。

文章头图及封面图片来源：imperial.ac.uk